VRTN基因SINE插入突变与杜洛克肋骨数、胴体及肉质性状关联分析

郝小静，韩丽娟，王彦平，赵雪艳，王继英

(1. 青岛市畜牧兽医研究所，山东 青岛 266000； 2. 青州市农业农村局，山东 潍坊 262500； 3. 山东省农业科学院畜牧兽医研究所，山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室，济南 250100)

【研究意义】猪的脊椎由颈椎、胸椎、腰椎、荐椎和尾椎五部分组成。颈椎数固定为7根，荐椎和尾椎比较保守、变化很小，猪的脊椎数的变异主要存在于胸椎和腰椎，其中胸椎数(肋骨数)变异范围为14～17根，腰椎数则为5～7根。中国地方品种猪未经商业化选育，胸腰椎总数以19～20根为主[1]。西方商业猪种对体型大小，特别是体长，进行了高强度的人工选育，从而使西方商业猪种的胸腰椎数也随之增加，达21～23根[2-3]。脊椎数的变异主要受遗传的影响，遗传力为0.6左右[4]，是一类高遗传力经济性状。研究表明，猪每增加1节脊椎，其胴体长度可增加10～30 mm[5-6]。猪脊椎数多的个体脊柱加长，背最长肌随之加长、腹腔容积增大，个体更粗壮强健。因此，脊椎数的选育，特别是胸、腰椎数的选育对于家猪育种具有重大的经济意义。【前人研究进展】为了解析猪脊椎数变异的遗传机理，研究人员利用资源群体开展了一系列研究，揭示了一些影响猪脊椎数的主效基因。目前，猪脊椎数主效基因的研究热点主要集中在1号染色体上的核受体亚家族6A组成员1(Nuclear receptor subfamily 6 group A member 1，NR6A1)基因和7号染色体上的椎骨发育相关(Vertebrae development associated，VRTN)基因。NR6A1基因的c.575 T>C是影响腰椎数的因果突变位点，TT基因型比CC基因型拥有更多的腰椎数[7]。但该位点在杜洛克、长白、大约克这些西方商业猪种中已经固定位TT基因型，无选育空间，但中国本地猪以CC基因型为主，故NR6A1基因可用于中国地方猪或含有中国地方猪血缘的新品种和配套系的选育[8-10]。VRTN基因是一个转录因子，其g.20311_20312处1段291 bp的短散在重复序列(Short interspersed repeated sequence, SINE)插入突变可通过加快分节钟增加胸椎(肋骨)数[11]。欧阳子璇等[12]在大规模杜长大三元杂交猪群中开展了此SINE插入突变与脊椎数表型的关联性分析，结果显示SINE插入突变对猪肋骨数影响效应极显著，插入基因型(ins/ins)比缺失基因型(-/-)的个体多出0.9根肋骨。而且，VRTN基因291 bp SINE插入突变具有“一因多效”性，在增加肋骨的同时增加0.5个乳头数，体长增加1.5 cm，产肉量增加1%以上[13-15]，同时不会对生长、繁殖[16-17]等其他生长性状产生负面效应，非常适合利用分子该标记遗传改良猪的肋骨数。除了NR6A1和VRTN这2个主效基因之外，近年来利用地方猪种开展的全基因组关联研究表明，LTBP2[18]、TGFB3[19]、BMPR1A[20]等也可以作为肋骨数变异的候选基因，但具体效果还有待验证。【本研究切入点】随着瘦肉型猪规模化、集约化不断加强，市场对大体型肥育猪的需求逐年增加，生猪生产逐渐向大体型、大出栏体重方向发展。如果能使商品猪的脊椎数在原有基础上有所增加，从而增大猪的体型，增加产肉量，会对整个养猪业带来重大的生产效益与经济效益。杜洛克猪因体型高大、生长速度快、饲料利用率高、肉质优良且适应性强，是瘦肉型商品猪生产中使用最广的终端父本。培育遗传稳定、生产性能优异的大体型杜洛克猪新品种(系)，满足国内对高、大、快、长父系种猪的需求，具有重要意义。【拟解决的关键问题】本研究针对山东省2个杜洛克种猪场核心群体，利用分子生物学方法对VRTN基因291 bp SINE插入突变进行检测，分析不同基因型与胴体和肉质性状的关系，为下一步实施分子标记辅助育种，提高杜洛克的体长和产肉量奠定基础。

1 材料与方法

1.1 样品采集及表型测定

本研究实验样本来自山东潍坊江海原种猪场28头杜洛克猪和山东成大现代农业科技有限公司18头杜洛克猪。实验猪体重110 kg左右，公、母各半。屠宰前24 h，试验猪禁食，自由饮水。电击致晕后心脏放血，按照标准流程屠宰。屠宰时用剪刀截取小块耳组织放入eppendorf离心管中，加入70%酒精，带回实验室-20 ℃保存备用。

按参考文献[21]测定宰前活重、胴体重、屠宰率、胴体长、平均背膘厚(肩部最厚处、胸腰结合处、腰荐结合处)、眼肌面积和瘦肉率等。胴体劈半后，数肋骨数，并采集左边胴体背最长肌样品，按参考文献[22]测定pH、嫩度、肌纤维直径、肌内脂肪含量等肉质性状。

1.2 基因组DNA提取

利用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(DP304，天根生化科技有限公司)按照说明书流程提取杜洛克猪耳组织基因组DNA。利用NanoDrop检测基因组DNA的浓度，调整浓度为50 ng/μL用于PCR扩增。

1.3 VRTN基因型检测

引物序列参考文献[3]，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。上游引物为5’-GGCAGGGAAGGTGTTTGTT-3’，下游引物为5’-GACTGGCCTCTGTCCCTTG-3’。PCR扩增反应体系：2×TaqPCR Mastermix[天根生化科技(北京)有限公司，KT201]10 μL，上、下游引物各1 μL(20 pmol/μL )，50 ng/μL模板1 μL，加双蒸水至20 μL。反应条件：94 ℃变性5 min，35次循环(94 ℃，30 s；60 ℃，30 s；72 ℃，1 min)，72 ℃延伸8 min。VRTN基因影响肋骨数是通过1段291 bp的序列插入造成，2.5%琼脂糖电泳检测PCR产物即可见多态性。

1.4 数据统计与分析

利用Excel统计VRTN基因SINE插入突变的基因型频率、基因频率。利用R语言对突变位点进行Hardy-Weinberg平衡检验以及使用y=μ+G+e模型进行基因型与表型的关联分析，μ为表型均值，G为基因型，e为随机残差效应，对差异显著的性状采用Tukey法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 VRTN基因SINE插入突变基因型分析

VRTN影响肋骨数是通过1段291 bp的SINE插入突变(ins)起作用。设计引物，对包含291 bp的插入序列进行PCR扩增，利用琼脂糖电泳，根据条带进行VRTN基因型分型。其中插入基因型(ins/ins)只含有突变序列目的片段，电泳呈现1条411 bp带；缺失基因型(-/-)只含有非突变序列(-)目的片段，电泳呈现1条120 bp带；杂合基因型(ins/-)含有突变序列和非突变序列目的片段，电泳呈现2条带，分别为120和411 bp。部分样本VRTN基因型PCR电泳图见图1所示。

泳道1为DL 2000 marker；泳道3，8为缺失基因型(-/-)；泳道2，5，6，11，12，13插入基因型(ins/ ins)；其它泳道为杂合基因型(ins/-)

2.2 VRTN基因SINE插入突变基因频率分析

从表1可以看出，插入基因型(ins/ins)样本数最多(N=24)，频率为0.5217，其次是杂合基因型(ins/-)(N=17)，频率为0.3696，缺失基因型(-/-)样本数(N=5)最少，频率为0.1087。根据基因型结果，计算VRTN2个等位基因频率，其中，对肋骨数有利的等位基因(ins)频率为0.7065，不利的等位基因(-)基因频率为0.2935。

表1 VRTN基因SINE插入突变在杜洛克群体内的多态性分布

2.3 VRTN基因SINE插入突变基因型与表型性状的关联

SINE插入突变基因型对杜洛克肋骨数、胴体长、瘦肉率和乳头数有显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)影响(表2和图2)。-/-基因型的杜洛克猪肋骨数均14，ins/-基因型的杜洛克猪肋骨数为15，大多数ins/ins基因型的杜洛克猪肋骨为16根，少数杜洛克猪为15根，平均为15.82根，ins/ins基因型杜洛克猪比-/-基因型杜洛克猪的肋骨提高1.82根；另外，ins/ins基因型杜洛克比-/-基因型杜洛克的胴体长、瘦肉率和乳头数分别增加4.05 cm、3.3个百分比、2.26个，2种基因型间差异达显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)水平。ins/ins基因型杜洛克猪的胴体长、瘦肉率和乳头数虽然均比ins/-基因型杜洛克有所提高，但未达到显著水平。

表2 VRTN插入突变基因型对杜洛克肋骨数、胴体和肉质性状的影响

图2 VRTN基因SINE插入突变3种基因型对应的瘦肉率、胴体长、胴体重和乳头数

ins/ins基因型、ins/-基因型和-/-基因型杜洛克猪的眼肌面积分别为45.38、49.03和50.02 cm2，SIINE插入突变有降低眼肌面积的趋势，但未达到显著水平。SIINE插入突变对屠宰率、肌内脂肪、嫩度等性状没有影响。

3 讨 论

猪脊椎数的变异与胴体长和产肉量有关，脊椎数偏多的个体相对一般个体具有体型大、产肉性能高的特点。猪的肋骨数活体很难测定，常规育种难以提高。分子标记辅助选择可以从分子水平准确快速分析个体的遗传组成，从而实现对肋骨数的基因型选择，快速提高猪的脊椎数，将给养猪生产带来重大的经济效益。

前期研究表明，VRTN基因g.20311_20312 291 bp的SINE插入突变可显著影响猪的肋骨数，从而间接影响胴体长度[13]。长白猪、大白猪、杜洛克猪早期注重形体特别是体长的选择，SINE插入突变ins等位基因在这些猪品种中占优势。杜洛克、长白、大白这4个猪品种中，ins等位基因频率均大于0.5[13,23]。在本研究中，ins/ins、ins/-和-/-的基因型频率分别为0.5217、0.3696和0.1087，ins等位基因频率为0.7065，ins/ins基因型杜洛克猪的比-/-基因型杜洛克猪的多1.82根肋骨，因此，在杜洛克猪群体中ins等位基因占优势且能提高肋骨数，这与前人在欧洲商业猪群体中的研究结果相同[13,23]。

VRTN基因SINE插入序列对其它胴体和肉质性状也有影响。Yang等[13]在二花脸、杜洛克等群体中研究表明，VRTN基因SINE插入序列对胴体长有显著影响。与Yang等[13]研究结果一致，本研究中ins/ins基因型杜洛克猪比-/-基因型杜洛克猪的胴体长增加4.05 cm，SINE插入突变显著提高杜洛克猪的胴体长。Nakano等[23]对研究表明，SINE插入突变位点对眼肌面积、胴体重和肌内脂肪没有显著影响。Hirose等[24]对研究表明，SINE插入突变显著降低肌内脂肪含量，对日增重、背膘厚和眼肌面积没有显著影响。本研究中SINE插入突变对肌内脂肪无影响，与Nakano等[23]研究结果一致，但而与Hirose等[24]结果不一致。陈伟等[17]对大白猪群体研究表明，大白猪ins/ins基因型个体100 kg体重日龄显著高于-/-基因型个体，ins/ins基因型个体眼肌面积显著低于-/-基因型个体。本研究中SINE插入突变有降低体眼肌面积的趋势，但SINE插入突变对眼肌面积没有显著影响，与Nakano等[23]和Hirose等[24]研究结果一致，而与陈伟等[17]的研究不一致。Huang等[25]对PIC猪研究表明，SINE插入序列对胴体重有显著的负向影响。本研究中ins/ins基因型个体的胴体重显著小于ins/-基因型和-/-基因型个体，这与Huang等[25]报道相一致，而与Nakano等[23]报道不一致。

陈伟等与Hirose等[17,24]的研究结果均表明，VRTN基因SINE插入突变对产活仔数、总产仔数等繁殖性状无影响。Yang等[13]研究表明，SINE插入序列对乳头数有极显著影响。本研究结果与Yang等[13]的结果一致，ins/ins基因型个体具有更多的乳头数，而乳头数是繁殖性状中的重要指标，故VRTN基因SINE插入突变可能会通过影响乳头数从而对繁殖性能产生有利影响。

4 结 论

杜洛克群体内ins等位基因占优势，ins/ins基因型能显著提高猪的肋骨数(P<0.01)、胴体长(P<0.01)、瘦肉率(P<0.05)和乳头数(P<0.01)，显著降低胴体重(P<0.01)，有降低眼肌面积的趋势但未达到显著水平，对肌内脂肪、嫩度等肉质指标无显著影响。VRTN基因SINE插入突变具有一因多效的作用，其育种价值多是正向的，可以用于杜洛克猪分子标记辅助育种。