落粒实生麦苗穗发芽抗性鉴定及遗传背景研究

张希太，肖 磊，董 策

(邯郸市农业科学院生物技术研究室，河北 邯郸 056001)

【研究意义】在“一年两熟”种植模式的黄淮麦区，当年5月下旬—6月上旬，大田小麦成熟收获时由于粗放的操作往往不可避免的造成部分麦粒、麦穗遗落于大田。小麦收获后种植大秋作物(以玉米为主)，这些遗落于大田中的麦粒、麦穗在遇到夏季充沛的降雨后陆续开始萌发成落粒实生麦苗(野生麦苗)。一般前期萌发出土的落粒实生麦苗随着玉米田的除草而被除去，中期萌发出土的落粒实生麦苗受到玉米植株的遮挡不能见光一般难以生长成活，直到9月底10月初大秋作物收获后小麦播种耕地前，大田中往往还有少量才刚刚出土不久的落粒实生麦苗。这些萌发成实生麦苗的种子，在大田中经过了夏季充沛的降雨直到9月底 10月初才出土，应该具有很强的休眠特性，如果把这些小麦种子的强休眠特性能应用于当前的小麦的抗穗发芽育种,将成为穗发芽抗性极强的种质资源。【前人研究进展】小麦成熟期遇连续阴雨天气，导致麦粒在穗上发芽(穗发芽,He-harvest sprouting,PHS)是一种世界性的气候灾害。一旦发生就会给小麦生产造成严重的损失[1-3]。 目前，小麦育种科技工作者正在通过育种手段来提高所育小麦品种的抗穗发芽能力(小麦抗穗发芽育种)来对抗小麦成熟期遭遇不良气候而引起穗发芽灾害；小麦高抗穗发芽种质资源严重匮乏是限制当前小麦抗穗发芽育种取得突破的最主要障碍，小麦育种工作者正在通过各种途径寻找和利用各种技术手段创制小麦高抗穗发芽种质资源[3-18]，因此创制或收集高抗穗发芽的小麦种质资源材料是当前小麦抗穗发芽育种亟待解决的首要问题。【本研究切入点】为了获得小麦高抗穗发芽种质资源，开展分批收集7月上旬—10月上旬出土小麦落粒实生苗集中移栽，进行穗发芽抗性鉴定和部分高抗穗发芽落粒实生苗遗传背景及亲缘关系分析的研究，旨在为获得小麦抗穗发芽新种质资源开辟新的途径。

1 材料与方法

1.1 落粒实生麦苗的收集与集中移栽

本试验落粒实生麦苗的收集地点为河北省成安县商城镇赵横城村北农田。在3个时间段内分3批收集大田中的落粒实生麦苗，Ⅰ:7月1—31日；Ⅱ:8月1—31日；Ⅲ:9月1日—10月10日。收集后移栽入营养钵中，成活后放于阴凉处越夏，越夏时如遇麦苗徒长，可用生长抑制剂(多效唑或烯效唑)处理，抑制其生长保证安全越夏。每时间段(每批)收集移栽落粒实生麦苗的数量不少于200株。当年的10月中旬将收集越夏后的落粒实生麦苗，按不同的批次集中移栽入位于河北省成安县商城镇赵横城村北本研究室试验田的观察圃中，株距20 cm，行距30 cm。移栽后及时浇水保证成活，整个生育期加强水肥管理保证生长茁壮(图1)。

图1 大田中的落粒实生麦苗

1.2 落粒实生麦苗的生长一致性观察

整个生育期调查所有移栽的落粒实生麦苗的几个突出的外观农艺性状,包括株高(高于，低于)、穗型(纺锤形，圆锥形，椭圆形，长方形，棍棒型，分支型)、芒型(无芒，直芒，曲芒)、芒色(黄，红，黑)、植株蜡质(无，有，强)、旗叶姿态(直立，平展，下披)、茎秆颜色(黄色，紫色)。统计各性状植株占本批次总群体的百分数，以前茬种植的小麦品种为对照进行比较分析。

1.3 落粒实生麦苗的穗发芽指数测定

穗发芽指数测定参照《中华人民共和国农业行业标准(NY/T 1739—2009)》[19]进行。具体试验方法为：在小麦生理成熟期(穗茎和颖壳转黄时的蜡熟期)从田间采取各批次落粒实生麦苗植株和对照“泰山2号”植株的整株麦穗约5～10个/株，从穗下茎15～20 cm处剪取。先用自来水浸泡4 h，然后用0.1%的次氯酸钠溶液消毒5 min，再用无菌水反复冲洗。将麦穗插在泡沫塑料板上，放在人工气候箱中，每天模拟降雨喷水2次，温度为22 ℃，相对湿度为100% 培养96 h，随即放在60 ℃的烘箱中烘干。然后手工剥粒调查统计每植株麦穗的发芽粒数(以种子籽粒胚部种皮破裂为发芽标准)和总粒数，计算穗发芽率。穗发芽率X=100×(试验穗发芽粒数/试验穗总粒数)、相对穗发芽指数I=待测样品的穗发芽率X1/对照品种的穗发芽率X2，进一步进行抗穗发芽级别评价(I<0.05为高抗；0.05≤I≤0.2为抗；0.21≤I≤0.4为中抗； 0.41≤I≤0.6为感；I>0.6为高感)。

1.4 落粒实生麦苗抗穗发芽性状的遗传背景(亲缘关系)分析

1.4.1 落粒实生麦苗抗穗发芽性状遗传的环境因素分析 大田落粒实生麦苗是由当年5月底或6月初小麦收获时,因粗放操作遗落于大田中的部分麦粒萌发生长而来。特别是9月上旬至10月上旬出土的落粒实生麦苗的种子，在土壤中经过夏季充沛的降雨，直到9月份以后才发芽出土，因此都具有很强休眠特性和抗穗发芽能力。这充分说明在自然界小麦生产庞大的群体中存在着种子休眠性强高抗穗发芽的基因及其表型。分析这些高抗穗发芽基因的来源：①可能是小麦本身基因发生的突变，但这种可能性几率很低；②小麦的伴生杂草野麦子(野燕麦Avena.fatua、节节麦AegilopstauschiiCoss.等)的种子都具有极强的休眠特性和抗穗发芽能力[12,16-17]。这些与小麦属于同一亚科的抗穗发芽植物，在长期与小麦的共同生长中存在着自然杂交的可能，通过自然杂交将种子的强休眠抗穗发芽基因转给小麦的可能性较大。特别是节节麦和小麦分别属于小麦族的山羊草属与小麦属,亲缘关系较近,在小麦的进化史上,曾经成功的通过属间自然杂交为现代小麦贡献了D染色体组，因此，节节麦和小麦发生自然杂交的可能性极大。通过观察大田小麦中伴生的野燕麦和节节麦发现，野燕麦的扬花期和小麦不同步(图2-A)，所以野燕麦和小麦发生自然杂交的可能性较小。野燕麦和小麦分别属于燕麦族和小麦族，亲缘关系较远，即使发生了远缘杂交,不通过人工幼胚抢救培养也难以发育成苗；而大田中与小麦伴生的节节麦的扬花期和小麦同步(图2-B)，二者又有较近的亲缘关系和成功发生自然杂交的历史事实，因此现代发生自然杂交的可能性较大。刘登才等[13]在进行节节麦和普通小麦的远缘杂交研究时，发现有些节节麦类型和普通小麦远缘杂交的幼胚不需要胚抢救培养也能形成种子并发育成苗，因此大田中的落粒实生抗穗发芽麦苗极有可能是小麦伴生的节节麦和普通小麦的自然杂交后代。

图2 大田中和小麦伴生的野燕麦(A)与节节麦(B)

1.4.2 落粒实生抗穗发芽麦苗疑似亲本小麦品种的调查 调查收集落粒实生麦苗地块,在收集落粒实生麦苗之前近10年间,种植过的小麦品种,这些种植过的小麦品种都有可能是和节节麦发生自然杂交的亲本。然后采用这些疑似亲本的小麦品种和生长于同地块中的节节麦进行人工远缘杂交验证和基因组DNA分析。

1.4.3 落粒实生麦苗大田中的节节麦与小麦人工远缘杂交试验验证 在收集落粒实生麦苗的大田中,分别种植在收集落粒实生麦苗之前近10年来种植过的小麦品种和当前生产上正在种植的前茬小麦新品种“中信麦68”。在小麦的扬花初期,对种植的各小麦品种进行整穗，去雄，套袋，然后收集本地块中正在扬花的节节麦穗，利用节节麦的花粉迅速给各小麦品种整穗去雄后的雌蕊柱头授粉然后套袋隔离，每个小麦品种都留有部分整穗去雄后的穗子不授粉直接套袋隔离作为对照。小麦成熟收获前，分别收回杂交试验穗和对照穗，统计各小麦品种授粉穗和对照穗的结实数并计算其结实率。

1.5 落粒实生抗穗发芽麦苗基因组DNA分子标记分析

1.5.1 SSR分子标记引物的选择 基于落粒实生抗穗发芽麦苗遗传的环境因素分析与人工远缘杂交验证，在分子遗传水平上重点检测,落粒实生抗穗发芽麦苗和节节麦的遗传关系。因为节节麦和现代小麦具有同源的D染色体组,在发生自然杂交后,节节麦和小麦D染色体组间可以实现同源染色体配对,通过同源染色体间易位交换遗传物质的可能性极大。所以首先选用现有开发成功的小麦D染色体组上的SSR位点的引物进行PCR检测。

1.5.2 检测材料DNA的提取 从落粒实生麦苗中随机选取10株穗发芽抗性最好的编号1～10后作为被检材料，检测用的节节麦和被检测落粒实生抗穗发芽麦苗都来源于同一地块。疑似亲本小麦品种从该品种育种者处收集。将节节麦、实生抗穗发芽麦苗、疑似亲本小麦品种的种子用0.1%的升汞溶液灭菌8分钟，用无菌水反复冲洗5～6遍。疑似亲本小麦品种的种子直接播种到湿沙盘中；节节麦、实生麦苗抗穗发芽种质系的种子，先用10 mg/L的赤霉素溶液浸种5 h后再分别播种于湿沙盘中。均在25 ℃恒温箱中保湿培养，长成幼苗后剪取幼嫩叶片采用SDS法分别提取总DNA并纯化，用无菌超纯水稀释成20 ng/μL的模板液放于4 ℃冰箱中备用[20]。

1.5.3 SSR-PCR反应体系的构建与反应程序 PCR反应体系的构建，采用25 μL反应体系，各成分的含量为：TaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.2 μL、10×Buffer 2.5 μL、MgCl2(25 mmol/L) 2 μL、dNTP(2.5 mmoL/L) 1 μL 、上下游引物(工作浓度) 各1 μL、DNA模板液(20 ng/μL) 0.5 μL、无菌超纯水 16.8 μL； PCR反应在英国TECHNE公司生产的TC-5000 PCR仪上进行，反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性50 s，(退火时间为50 s，退火温度参考不同引物的合成报告单推荐温度微作调整)72 ℃延伸1 min(30个循环)；72 ℃后延伸5 min，4 ℃保存。

1.5.4 SSR-PCR反应产物的电泳检测 PCR扩增反应产物采用8%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳检测，每泳道上样量为8 μL，在200 V恒电压下电泳5 h，剥胶，银染，照相，进行扩增条带的分析。

2 结果与分析

2.1 落粒实生麦苗的收集与移栽成活情况

由表1可知，当年的10月中旬，将收集并越夏后的落粒实生麦苗根部带土移栽入观察圃，及时浇水后都能100%成活。

表1 落粒实生麦苗的收集与移栽成活情况

2.2 落粒实生麦苗的生长一致性观测

由表2可知，当年7月份收集的第Ⅰ批落粒实生麦苗植株几个突出外观的农艺性状较为统一，仅在株高、穗型、植株蜡质出现了7%、3.5%、2%的不一致植株。93%以上的落粒实生麦苗植株的农艺性状和前茬种植的小麦品种一致，说明7月份收集的第Ⅰ批落粒实生麦苗主要是由前茬种植的小麦品种的落粒萌发而成；当年8月份收集的第Ⅱ批落粒实生麦苗植株几个突出的外观农艺性状表现很不统一和前茬种植的小麦品种都不完全一致，说明第Ⅱ批落粒实生麦苗不是由前茬种植的小麦品种的落粒萌发而成；当年9月份和10月上旬收集的第Ⅲ批落粒实生麦苗植株几个突出的外观农艺性状表现很不统一和前茬种植的小麦品种都不完全一致，说明不是由前茬种植的小麦品种的落粒萌发而成。

表2 各批次落粒实生麦苗的几种外观的农艺性状所占百分比

2.3 落粒实生麦苗穗发芽指数的测定

由表3可知，当年7月份收集第Ⅰ批落粒实生麦苗植株植株腊熟期麦穗穗发芽抗性都未能达到高抗级别，只有2.3%能达到抗级别，3.6%达到中抗级别，而94.1%落粒实生麦苗植株腊熟期麦穗感穗发芽；当年8月份收集的第Ⅱ批落粒实生麦苗植株腊熟期有44.8%麦穗穗发芽抗性达到高抗级别，其中3.6%相对穗发芽指数为零。83.2%达到抗穗发芽级别以上，100%能达到中抗级别，无感穗发芽植株；当年9月份和10月上旬收集的第Ⅲ批落粒实生麦苗植株腊熟期有78.8%麦穗穗发芽抗性达到高抗级别，其中19.5%相对穗发芽指数为零。96.6%达到抗穗发芽级别以上，100%能达到中抗级别，无感穗发芽植株。随着收集时间向后推移，收集落粒实生麦苗高穗发芽抗性级别所占比例越高。

表3 各批落粒实生麦苗所占相应穗发芽抗性级别的百分比

2.4 收集实生麦苗大田中的节节麦与小麦人工远缘杂交试验

由表4可知，收集实生麦苗大田中的节节麦与小麦品种“济麦22”“邯6172”“衡4399”“中信麦68”人工远缘杂交的结实率大约都在5%左右而相应对照的结实率都为0,这充分说明了大田中的节节麦与普通小麦品种之间是能够进行杂交结实的。

表4 大田中节节麦与小麦人工远缘杂交试验结实率

收集实生麦苗大田中的节节麦与普通小麦品种远缘杂交的结实率虽然很低，但对于庞大的与节节麦长期共生的小麦生产群体来说，二者发生自然杂交结实的可能性还是有的。二者一旦发生自然杂交结实,特别是节节麦接授普通小麦花粉后所产生的杂交种子落入土壤中的几率更大。这些杂交后代种子落入土壤后，其深度休眠特性(抗穗发芽特性)就会被自然定向选择，群体数量不断扩大，于是便形成了一定数量的秋季大田抗穗发芽实生麦苗群体。

2.5 部分落粒实生抗穗发芽麦苗的SSR-PCR检测

引物Xgdm33(检测位点位于1A、1D染色体)在高抗穗发芽落粒实生麦苗的基因组DNA中检测到了920、800、700、650、70 bp 大小(图3小箭头所示)的和节节麦一致而小麦亲本没有的条带，这充分说明了高抗穗发芽落粒实生麦苗和同一大田中生长的节节麦的亲缘关系；引物Xgdm33同时在高抗穗发芽落粒实生麦苗的基因组DNA中还检测到了大小约为380、170、160、140 bp(图3大箭头所示)的和3个小麦亲本一致而节节麦没有的条带这充分说明了高抗穗发芽落粒实生麦苗和小麦亲本的亲缘关系。

M:分子量标准物(自上向下依次为：1000、900、800、700、600、500、400、300、200、100 bp),1：节节麦，2～11：高抗穗发芽的落粒实生麦苗，12：济麦22，13：邯6172，13：衡4399

引物Xgwm52(检测位点位于3D染色体) 在高抗穗发芽落粒实生麦苗的基因组DNA中也检测到了大小约为350 bp(图4小箭头所示)的和节节麦一致而小麦亲本没有的条带，这也充分说明了高抗穗发芽落粒实生麦苗和同一大田中生长的节节麦的亲缘关系；同时引物Xgwm52在高抗穗发芽落粒实生麦苗的基因组DNA中还检测到了大小约为160、150、140 bp(图4大箭头所示)的和3个小麦亲本一致而节节麦没有的条带这充分说明了高抗穗发芽落粒实生麦苗和小麦亲本的亲缘关系；引物Xgwm52在高抗穗发芽落粒实生麦苗、节节麦和3个亲本小麦品种的基因组DNA中还检测到了大小约为240、180 bp(图4方箭头所示)都一致的条带，这是节节麦和普通小麦存在远古亲缘关系的证据。

M：分子量标准物(自上向下依次为900、800、700、600、500、400、300、200、100 bp)1：节节麦，2～11：高抗穗发芽的落粒实生麦苗，12：济麦22，13：邯6172，13：衡4399

3 讨 论

高抗穗发芽种质资源的匮乏是限制小麦抗穗发芽育种取得突破的主要瓶颈,获得具有绝对抗性的高抗穗发芽种质资源一直是小麦育种工作者的期望。过去我国对现有的大量小麦品种资源材料进行了抗穗发芽鉴定，以期筛选出抗穗发芽特性好的材料[3-8]。发现了一些穗发芽抗性与种子萌发生理上的关系,抗性与麦穗形态、颖壳、种皮颜色上的关系，也选出了一些抗性相对较好的材料。但是受现有小麦遗传背景的限制并没有从根本上找到抗穗发芽的抗源基因。

随着生物技术的发展，基因工程技术应用于小麦抗穗发芽种质资源的创制。美国农业部农业研究局和堪萨斯州立大学通过对小麦全基因组测序研究克隆成功了PHS基因，转PHS小麦的穗发芽受到明显抑制[9]；国家小麦工程技术研究中心克隆的反义硫氧还蛋白基因(anti-trxs)转入小麦后，获得的00T89、01TY18转基因株系，穗发芽率较对照分别降低35.5% 和62%[10-11]。基因工程技术拓宽了抗穗发芽育种遗传的物质基础，具有广阔的发展前景。出于转基因安全性的考虑，目前转基因技术在小麦这种主要粮食作物上的应用受到了国家的严格限制。

自然界中存在着和小麦同族不同属的节节麦(分属于小麦属与山羊草属)有着极强的高抗穗发芽特性[12,16-17]。利用节节麦的高抗穗发芽基因创造小麦高抗穗发芽种质资源，一直是我国科技工作者研究的热点。兰秀锦等[12]对节节麦的抗穗发芽基因进行了染色体定位研究，确定了节节麦的抗穗发芽基因是隐性单基因位于2D染色体上，以四倍体的地方小麦品种矮兰麦做母本与采自河南的节节麦进行杂交，F1代用秋水仙素进行染色体加倍获得的双二倍体小麦RSP其穗发芽率仅为2.86%[14-15]；苏亚蕊等[16-17]也在“节节麦的抗穗发芽特性进行了鉴定及遗传多样性研究”和“节节麦和小麦杂交后代的抗穗发芽特性鉴定及节节麦抗穗发芽基因所在相关染色体定位分析”等方面作了大量工作。这些研究都在节节麦和小麦的远缘杂交后代中获得了高抗甚至于极抗穗发芽材料，丰富了小麦抗穗发芽育种的遗传背景，有效利用了节节麦中的极抗穗发芽基因，为小麦抗穗发芽育种提供了宝贵的种质资源。

本研究从自然存在的小麦生产大田落粒实生麦苗中收集、筛选小麦高抗穗发芽种质资源材料；分析了落粒抗穗发芽实生麦苗的遗传背景，进行了大田节节麦和小麦远缘杂交验证并从分子水平上证明了大田抗穗发芽实生麦苗是大田中的野生节节麦和大田以往种植的小麦品种进行天然远缘杂交的后代，具有和节节麦相同的极强的抗穗发芽特性。此获取小麦高抗穗发芽材料的方法简单易行，成本低廉，有效地利用了节节麦中的远缘抗穗发芽基因资源，为小麦抗穗发芽育种提供了宝贵的种质资源。

4 结 论

(1)本研究发现了一条获得小麦抗穗发芽种质资源的新途径。通过收集、移栽、鉴定大田落粒实生麦苗获取小麦抗穗发芽种质资源，不仅能为小麦抗穗发芽育种提供宝贵的种质资源更加丰富了小麦抗穗发芽育种遗传的物质基础。

(2) 通过人工远缘杂交验证与分子标记遗传分析，从分子水平上证明了大田落粒实生麦苗中的高抗穗发芽植株是大田中的野生节节麦与以往种植的普通小麦品种天然杂交的后代。