金银花饮片

万莹莹　杜微波　陈敬然　张志强　沈建梅

摘要： 为了阐明金银花饮片—标准汤剂量质变化及其分布规律，采用UPLC建立金银花饮片—標准汤剂特征图谱方法，并根据质谱分析进行化合物推断;利用新公式-K值分析化合物传递过程中的规律。结果表明，UPLC特征图谱方法重复性、精密度、稳定性良好;对11个特征峰进行结构推断，确定了9个特征峰：新绿原酸（峰1）、绿原酸（峰2）、断氧化马钱苷酸（峰3）、隐绿原酸（峰4）、獐牙菜苷（峰5）、断氧化马钱子苷（峰6）、异绿原酸B（峰8）、异绿原酸A（峰9）、异绿原酸C（峰11）;由K值分析可知，15批金银花饮片—标准汤剂过程各峰都进行了传递，新绿原酸和隐绿原酸K值大于1，绿原酸K值小于1，与绿原酸异构化生成新绿原酸和隐绿原酸有关;异绿原酸B和异绿原酸C的K值大于1，异绿原酸A的K值小于1，与异绿原酸A异构化生成异绿原酸B和异绿原酸C有关。由此，通过K值可分析金银花标准汤剂中量质传递规律，且符合有机酸类化学成分特性。建立的特征图谱方法准确、稳定、可靠，金银花饮片—标准汤剂新公式-K值能够辅助分析饮片—标准汤剂的量质传递规律，可为后续以标准汤剂为基准的配方颗粒或经典方制剂质量控制提供依据。

关键词：中药化学;金银花;标准汤剂;UPLC特征图谱;量质传递

中图分类号：R284.1文献标识码：A

DOI： 10.7535/hbgykj.2022yx02006

Study on quantity-quality transfer from Lonicera Japonica Flos to standard decoction

WAN Yingying DU Weibo CHEN Jingran ZHANG Zhiqiang SHEN Jianmei

（1Beijing Tcmages Pharmaceutical Company Limited，Beijing 101301，China;2Traditional Chinese Medicine Formula Particles Key Technology National United Engineering Research Center，Beijing 101301，China;3Beijing Chinese Medicine Formula Particles Engineering Technology Research Center，Beijing 101301，China）

Abstract：In order to clarify the change rule and distribution of Lonicera Japonica Flos decoction pieces-standard decoction，the method of establishing specific chromatogram was used by UPLC for Lonicera Japonica Flos-standard decoction，and the compounds were inferred according to mass spectrometry analysis;The new formula-K value was used to analyze the rule of compound transferThe results show that the UPLC specific chromatogram method has good reproduciblity，precision and stability;The structures of 11 characteristic peaks were inferred，and 9 characteristic peaks were determined as：neochlorogenic acid （peak 1），chlorogenic acid （peak 2），secologanoside 7-methyl ester （peak 3），cryptochlorogenic acid （peak 4），sweroside （peak 5），secoxyloganin （peak 6），isochlorogenic acid B （peak 8），isochlorogenic acid A （peak 9），isochlorogenic acid C （peak 11）;By K analysis，each peak of 15 batches of Lonicera Japonica Flos-standard decoction was transferred，the K values of neochlorogenic acid and cryptochlorogenic acid are greater than 1，and the the K value of chlorogenic acid is less than 1，which is related to the isomerization of isochlorogenic acid A into isochlorogenic acid B and isochlorogenic acid CTherefore，K values can be used to analyze the quantity-quality-transfer law in the standard decoction of Lonicera Japonica Flos，and it conforms to the chemical composition characteristics of organic acidsThe established method of specific chromatogram are accurate，stable and reliable，and the new formula K value can assist in the analysis of quantity-quality transfer law of decoction pieces-standard decoction，which can provides a basis for the quality control of standard decoction as the formulation granules or the classic preparation

Keywords： chemistry of Chinese material medical;Lonicera Japonica Flos;standard decoction;UPLC specific chromatogram;quantity-quality transfer

金银花为忍冬科植物忍冬Lonicera Japonica Thunb的干燥花蕾或带初开的花[1]。有机酸类、黄酮类、环烯醚萜苷类成分是金银花主要活性成分及发挥疗效的物质基础[2-6]，其中有机酸类易溶于水，同分异构体较多，如新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸互为同分异构体，异绿原酸A，B，C互为同分异构体，且在金银花饮片—标准汤剂的提取过程中，受温度、pH值及化合物中不稳定结构的影响，通过水解和分子内酯基迁移而易发生同分异构体之间的转化[7-12]。近年来，对金银花HPLC指纹图谱建立的研究多有报道[13-15]，为金银花的质量评价提供了一定的参考信息。中药配方颗粒是以饮片为原料，以水为提取溶媒经现代工艺提取、浓缩、干燥、制粒而成的单味中药颗粒剂[16]，其质量标准研究中，标准汤剂的物质成分分析最为重要[17]，然而现有的研究技术并不能全面地分析并阐明饮片—标准汤剂量质传递及分布的情况。本研究拟建立能够反映金银花饮片—标准汤剂的UPLC特征图谱方法，并对11个特征峰进行结构推断，结合新的公式-K值，以分析金银花饮片—标准汤剂量质变化情况，明确量质传递及分布情况，为科学、合理地筛选金银花标准汤剂质量控制指标提供依据。

1仪器及试药

1.1仪器

ACQUITY UPLCH-Class超高效液相色谱仪，美国Waters公司提供;ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）色谱柱，美国Waters公司提供;Agilent 6530 Q-TOF高分辨飞行时间质谱仪，美国Agilent公司提供;KQ-300DB超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司提供;DZKW-4电子恒温水浴锅，北京中兴伟业仪器有限公司提供;LGJ-50FD真空冷冻干燥机，北京松源华兴科技发展有限公司提供。

1.2试药及试剂

新绿原酸（批号：B21396，20 mg/支），上海源叶生物科技有限公司提供;绿原酸（批号：110753-202018，20 mg/支），中国食品药品检定研究院提供;隐绿原酸（批号：B215887，20 mg/支），上海源叶生物科技有限公司提供;异绿原酸A（批号：P28O7F23862，20 mg/支），上海源叶生物科技有限公司提供;异绿原酸B（批号：P25J6F1793，20 mg/支），上海源叶生物科技有限公司提供;异绿原酸C（批号：P25J6F1794，20 mg/支），上海源叶生物科技有限公司提供;金银花对照药材（批号：121060-201608，0.5 g/支），中国食品药品检定研究院提供;乙腈（5 L/瓶），甲酸（500 mL/瓶），均为色谱纯，美国Fisher化学公司提供;水为屈臣氏蒸馏水。15批金银花药材由北京康仁堂药业有限公司提供，经北京康仁堂药业有限公司质量检测中心鉴定为忍冬科植物忍冬Lonicera Japonica Thunb的干燥花蕾或带初开的花，经检验均符合《中国药典》（2020年版）规定，见表1。

2方法与结果

2.1金银花标准汤剂的制备

将金银花药材按《中国药典》（2020年版）金银花饮片炮制的规定进行炮制，获得金银花饮片。取饮片于砂锅中，浸泡30 min，一煎加饮片量16倍水，武火（500W）煮沸后，文火煎煮20min，趁热过滤，迅速冷却，备用;二煎加饮片量12倍水，武火煮沸后，文火（200W）煎煮15min，趁热过滤，迅速冷却备用;合并滤液，浓缩（50 ℃以下），浓缩至料液比约为1∶1（相对密度为105～110，50 ℃），冷冻干燥，即得。

2.2特征图谱方法

2.2.1色谱条件及系统适用性试验

以十八烷基硅烷鍵合硅胶为填充剂，采用ACQUITY UPLC HSS T3（柱长为10 cm，柱内径为2.1 mm，粒径为1.8 μm）色谱柱，以乙腈为流动相A，0.2%（体积分数）甲酸为流动相B，按照表2中的程序进行梯度洗脱;检测波长为238 nm;柱温为30 ℃;流速为0.4 mL/min。理论塔板数按2号峰计算应不低于7 000。

2.2.2参照物溶液的制备

取金银花对照药材，研细，取约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入体积分数为70%的乙醇50 mL，称重，加热回流1 h，放冷，摇匀，再称定质量，并补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。另取绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C对照品适量，精密称定，加体积分数为70%的乙醇制成每1 mL各含0.4 mg的溶液，摇匀，作为对照品参照物溶液。

2.2.3供试品溶液的制备

取标准汤剂冻干粉适量，研细，取约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入体积分数为70%的乙醇50 mL，称重，加热回流1 h，放冷，摇匀，再称定质量，并补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.4方法学考察

1）重复性试验

按照2.2.3项下方法制备供试品溶液6份，记录其特征图谱，以绿原酸为参照峰，计算各特征峰的相对保留时间和峰面积，由结果可知，相对保留时间RSD为0.0%～0.5%，相对峰面积RSD为0.0%～5.4%，表明该方法重复性良好。

2）中间精密度试验

采用不同仪器按照2.2.3项下方法获得6份供试品溶液的特征图谱，以绿原酸为参照峰，计算各特征峰的相对保留时间和峰面积可知，相对保留时间RSD为0.0%～1.5%，相对峰面积RSD为0.0%～5.2%;不同仪器间相对保留时间RSD为0.0%～1.2%，相对峰面积RSD为0.0%～11.2%，表明该特征图谱在不同仪器间的相对保留时间符合分析要求，不同仪器间的相对峰面积差异较大。

3）稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液，分别于0，2，4，8，12 h进样测定，记录色谱图，并以绿原酸为参照物峰，计算各特征峰的相对保留时间和峰面积，相对保留时间RSD为0.0%～2.1%，相对峰面积RSD为0.0%～6.8%，表明供试品溶液在12 h内测定结果稳定。

2.2.5特征峰的推断与确认

按照2.2项下“特征图谱方法”制备15批标准汤剂供试品溶液并测定，使用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（20121版），以2号为参照图谱，按中位数计算，进行共有峰标识，生成对照图谱，并确定峰1为新绿原酸、峰2为绿原酸、峰4为隐绿原酸、峰8为异绿原酸B、峰9为异绿原酸A、峰11为异绿原酸C，见图1。利用高效液相串联高分辨飞行时间质谱仪对11个特征峰进行结构推断，确定了9个特征峰的分子式，并参考金银花化学成分相关文献，推断了9个特征峰，其中峰1，2，4，8，9，11为有机酸类成分，峰3，5，6为环烯醚萜苷类成分，化合物结构见图2，推断结果见表3。

2.3饮片—标准汤剂量质传递分析

按照2.2项下“特征图谱方法”获得15批饮片的特征图谱数据，以11个特征峰峰面积、样品浓度及出膏率计算K值，分析饮片—标准汤剂量质传递情况，结果见表4;采用相同方法，对绿原酸和异绿原酸A对照品进行处理，考察其异构体的转化情况，结果见图3。

K=标准汤剂特征峰峰面积×饮片浓度×出膏率/饮片特征峰峰面积×标准汤剂浓度。

由表4可知，15批金银花饮片与标准汤剂各峰都进行了量质传递，特征图谱中的绿原酸、断氧化马钱苷酸、獐牙菜苷、断氧化马钱子苷、峰7、异绿原酸A、峰10，各峰K值小于1，但受产地因素的影响，断氧化马钱子苷和峰7中分别有3个和1个批次K值略大于1，其余均在0.21～0.99范围内，表明各峰传递趋势相同且效率相近;新绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸C中各批次K值均大于1，在1.11～7.23范围内，表明传递过程中可能存在量质转化，从而该类成分得到有效富集;由图3可知，绿原酸和异绿原酸A对照品采用相同方法处理，均生成相应异构体，表明该处理方法可使二者成分发生异构化转变，且特征图谱与质谱推断结果相符。

3讨论

金银花标准汤剂作为中药饮片的水煎液，物质基础主要为水溶性成分，其中有机酸类作为主要活性物质，具有调节血脂、抗血小板聚集和血栓形成作用，其水溶性好，但受温度、pH值以及化合物不稳定结构影响较大，饮片—标准汤剂煎煮过程存在成[HJ2mm]分的损失和转化，且量质传递规律及分布无法监控。因此针对标准汤剂中主要活性物质，利用UPLC建立了真实反映标准汤剂量质传递规律及分布的特征图谱方法，该方法重复性、精密度、稳定性良好。

目前，特征图谱多采用相似度、特征峰相对保留时间及特征峰数目等评价方式，均属于定性评价，不适用于量质传递规律的总结。指标成分转移率以成分含量的相对值进行定量评价，能够表明物质成分的变化趋势，但仅适用于有对照品参照的成分。因此针对标准汤剂中该类成分，依据指标成分转移率公式，建立基于特征图谱分析量质传递规律的新公式-K值，以峰面积进行比对，在缺少成分对照品的前提下也能够进行分析，同时降低了多因子对于结果分析的影响，能够科学地分析饮片—标准汤剂量质传递规律。

金银花饮片及标准汤剂的3D全波长扫描提示，在238 nm时特征图谱信息较丰富，因此选择该波长作为检测波长，并进行K值分析，金银花饮片—标准汤剂过程中11个特征峰均进行了传递，除新绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸C中各批次K值均大于1外，各峰K值小于1，但偶有受产地因素影响使K值略大于1。有文献研究表明，有机酸类化合物在提取过程中，受酯键、不饱和双键和多元酚3个不稳定结构影响，会通过水解和分子内酯基迁移而发生异构化，且在中性和碱性条件下，绿原酸异构化为新绿原酸和隱绿原酸;异绿原酸A异构化为异绿原酸B和异绿原酸C [7-12]，因此，新绿原酸和隐绿原酸K值大于1，绿原酸K值小于1，可能与绿原酸异构化生成新绿原酸和隐绿原酸有关;异绿原酸B和异绿原酸C的K值大于1，异绿原酸A的K值小于1，可能与异绿原酸A异构化生成异绿原酸B和异绿原酸C有关。由此可知，金银花标准汤剂中上述成分传递规律符合有机酸类成分的特性，表明K值能够辅助分析饮片—标准汤剂的量质传递情况，利用该传递规律可更好地指导中药配方颗粒的生产和质量控制。

4结语

本研究利用金银花标准汤剂专属性UPLC特征图谱方法，结合新的评价公式-K值，能够表明饮片—标准汤剂量质变化规律，明确金银花标准汤剂的量质分布，指导标准汤剂质量控制指标的合理筛选。建立的特征图谱方法重复性、精密度及稳定性的RSD均符合方法学要求，表明该方法的重复性、精密度及稳定性良好;利用质谱仪确定了9个特征峰分别是：新绿原酸（峰1）、绿原酸（峰2）、断氧化马钱苷酸（峰3）、隐绿原酸（峰4）、獐牙菜苷（峰5）、断氧化马钱子苷（峰6）、异绿原酸B（峰8）、异绿原酸A（峰9）、异绿原酸C（峰11）;由15批金银花饮片—标准汤剂的K值可知，各批饮片特征峰都进行了量质传递，且传递规律与有机酸类成分结构特性相同，新绿原酸和隐绿原酸K值大于1，绿原酸K值小于1，为绿原酸异构化为新绿原酸和隐绿原酸;异绿原酸B和异绿原酸C的K值大于1，异绿原酸A的K值小于1，为异绿原酸A异构化为异绿原酸B和异绿原酸C。因此，本研究可为后续以标准汤剂为基准的配方颗粒或经典方制剂质量控制提供依据，也可为其他品种饮片—标准汤剂量质传递分析提供研究思路。

本次研究选取3个产地的金银花为研究对象，由K值分析可知，金银花饮片—标准汤剂的量质传递受产地因素影响，断氧化马钱子苷和峰7的传递规律会有不同，故需要收集更多批次及产地的样品进行研究，以确保评价公式-K值分析的准确性，并且尝试对其他品种进行K值分析，进一步证实评价公式K值的可靠性。

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