ABC亚家族G成员2基因多态性与小儿急性淋巴细胞白血病大剂量甲氨蝶呤治疗效果及肾功能损伤的关系

葛一蓉, 饶 媚, 毕 婧, 谭四海, 韩 斌

(湖北省恩施土家族苗族自治州中心医院 儿童血液消化肾病科, 湖北 恩施, 445000)

甲氨蝶呤(MTX)已被广泛用作儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)的大多数化疗方案中的抗癌剂。尽管MTX在临床上的应用取得了成功，但仍可能会存在副作用和毒性[1]。MTX的药代动力学、功效和毒性在不同患者间存在很大差异，这种差异可部分解释为编码MTX膜转运蛋白基因的序列差异[2-3]。MTX通过三磷酸腺苷(ATP)结合盒转运蛋白从细胞中输出，已知MTX的外向转运蛋白是ABC亚家族G成员2(ABCG2)[4]。由ABCG2基因编码的P-糖蛋白在多种组织中既可作为功能屏障，又可作为外排转运蛋白，可以影响多种抗癌药物的药代动力学。研究[5]显示ABCG2基因中的变体可改变P-糖蛋白的表达和功能。肿瘤细胞中P-糖蛋白的过表达导致多药耐药性，并且许多抗白血病药物(例如糖皮质激素、蒽环霉素和长春新碱)是P-糖蛋白的底物。尽管MTX不被视为P-糖蛋白底物，但MTX单药治疗的研究[6]表明，沉默的ABCG2多态性可能影响MTX治疗后的结果和毒性。本研究分析ABCG2基因多态性(rs2231137、rs2231142)对大剂量MTX(HDMTX)治疗效果和毒性的影响，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2011年1月—2019年1月在本院新诊断为ALL的患儿193例。纳入标准: ① DNA样本和临床数据具有可用性; ② 接受中国儿童白血病协作组儿童急性淋巴细胞白血病2008治疗方案(CCLG-ALL 2008)者; ③ 无唐氏综合征和既往恶性肿瘤史者。根据上述条件，本研究排除了26例不符合标准的患儿(19例患儿临床数据明显缺失, 1例患儿未按照CCLG-ALL 2008方案进行治疗, 4例患儿在没有进入巩固期或完成HDMTX治疗时经历早期复发或死亡, 1例患儿出现唐氏综合征, 1例患儿出现既往恶性肿瘤史)，其余167例患儿随访时间1.0～115.0个月，中位随访时间为75个月。CCLG-ALL 2008治疗方案经本院伦理委员会批准。所有监护人知情同意。

1.2 治疗方法

根据年龄、白细胞计数、免疫表型、细胞遗传学和分子畸变、强的松反应、诱导治疗结束时的形态学缓解[基于柏林-法兰克福-明斯特(BFM)临床试验方案风险标准]、治疗结束时的微小残留病(MRD), 将患儿分为标准风险组(SR组)和中间风险组(IR组)，并参照CCLG-ALL 2008中诱导治疗和巩固治疗的方案进行治疗[7]。在化疗巩固阶段(第8、22、36、50天)，患儿每2周接受4次HDMTX治疗。HDMTX的给药方式为: 总剂量的10%在0.5 h内通过静脉内输注完成，剩余的90%在23.5 h内使用(SR组的MTX剂量为2 g/m2, IR组的MTX剂量为5 g/m2)。分别在HDMTX输注开始后42、48、54 h, 以15 mg/m2剂量进行甲酰四氢叶酸解救治疗。48 h后的高血浆MTX水平(>0.25 μmol/L)定义为延长解救的指示。每天监测血浆中MTX水平，直至低于0.2 μmol/L。连续输注MTX 24 h以上，并在48 h收集2 mL的血液样品。依据制造商的说明书(美国TDx Abbott Laboratories), 通过荧光偏振免疫测定MTX血浆水平。

1.3 毒性和治疗效果评估

从HDMTX输注结束到下次HDMTX周期或HDMTX输注后14 d期间评估每个HDMTX周期后的毒性。血液毒性定义为血清血红蛋白水平降低(贫血)、白细胞减少和血小板计数减少。肝毒性定义为血清谷氨酸-丙酮酸转氨酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)或γ-谷氨酰转移酶(γ-GT)水平升高。肾功能损伤定义为血清肌酐或尿素水平升高。胃肠道毒性定义为存在腹泻、恶心、呕吐、肠梗阻、胃肠疼痛等。根据美国国家癌症研究所常见毒性标准4.0版对毒性进行分级。选择巩固期最高等级的个体毒性作为所有分析的终点。治疗效果通过事件的发生情况来反映，包括任何部位的疾病复发、任何原因的死亡或第二恶性肿瘤的发生。无事件生存(EFS)定义为从化疗首日至事件发生所经历的时间。末次随访时，对最终分析时没有不良记录结果的患儿进行检查。

1.4 基因分型

从外周血白细胞和(或)从存档的骨髓载玻片中分离基因组DNA。分别采用Qiagen FlexiGene试剂盒(德国Qiagen公司)和QIAamp DNA Mini试剂盒(Qiagen)从冷冻全血样品或骨髓载玻片中提取DNA。使用限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)基因分型方法测定ABCG2基因rs2231137、rs2231142位点的基因型，见图1。PCR扩增在以下条件下进行: 初始变性(95 ℃, 10 min), 40个变性循环(95 ℃, 15 s), 退火(60 ℃, 1 min), 延伸(72 ℃, 1 min)和延长(72 ℃, 7 min)。rs2231137引物序列: 正向为5′-CCCAGAGTCCTTATTCTTAGCC-3′, 反向为5′-GTGCCTCCTTCACACACAG-3′。rs2231142引物序列: 正向为5′-TGTTGTGATGGGCACTCTGATG-3′, 反向为5′-ATCAGAGTCATTTTATCCACAC-3′。扩增完成后, 将限制酶HpyCH4IV加入PCR产物中并在37 ℃下孵育4 h, 采用溴化乙锭染色的3%琼脂糖凝胶电泳分析RFLP。

A: ABCG2 rs2231137位点; B: ABCG2 rs2231142位点。图1 ABCG2不同基因型的代表性PCR-RFLP分析

1.5 统计学分析

2 结 果

2.1 ALL患儿的临床特征及治疗结果

167例ALL患儿年龄0.5～18.0岁，中位年龄4.9岁; 男80例(47.9%), 女87例(52.1%); 免疫表型包括B细胞140例(83.8%), T细胞21例(12.6%), 双表型2例(1.2%), 未表征4例(2.4%); SR组78例(46.7%), IR组89例(53.3%); 具有延迟的MTX间隙的周期包括0个周期92例(55.1%), 1个周期38例(22.8%), 2个周期24例(14.4%), 3个周期8例(4.8%), 4个周期 5例(3.0%); MTX的平均峰浓度(Cmax)为(72.5±54.3) μmol/L; MTX第1、2、3、4周期的平均AUC为(447.2±390.1)、(435.4±353.6)、(366.9±328.4)、(358.9±336.5) μmol/(L·h); 治疗结果为首次缓解133例(79.6%), 发生事件34例(20.4%)。

2.2 ABCG2基因型分布

通过PCR-RFLP基因分型方法确定了167例患儿ABCG2的2个单核苷酸多态性(SNPs), 其基因型分布见表1。rs2231137位点和rs2231142位点的基因型分布频率经χ2检验均在HWE中(P>0.05), 说明研究人群具有代表性。

表1 ALL患儿ABCG2基因多态性的频率(n=167)[n(%)]

2.3 ABCG2基因型与HDMTX化疗毒副作用的关系

167例ALL患儿接受HDMTX化疗的毒副作用以血液毒性(80.8%)为主，其次为胃肠道毒性(36.5%)、口腔黏膜炎(26.9%)、肝毒性(23.4%)和肾功能损伤(17.4%)。进一步分析ABCG2的2个SNPs与HDMTX化疗毒副作用的关系，结果显示rs2231137各基因型与HDMTX各类毒副反应的差异无统计学意义(P>0.05); rs2231142中(CT+TT)基因型个体发生肾功能损伤的风险较CC野生型提高了14.14倍，差异有统计学意义(OR=14.14, 95%CI为1.26～42.37,P=0.032)。见表2。

表2 ABCG2的2个SNPs与HDMTX化疗毒副作用的关系[n(%)]

2.4 ABCG2基因型与治疗效果的关系

为了确定所选SNPs对ALL患儿治疗结果的影响，本研究进行了单变量和多变量分析，结果显示rs2231137中(AG+AA)基因型个体的72个月EFS比GG基因型个体更差, rs2231142中(CT+TT)基因型个体的72个月EFS比CC基因型个体更差，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 ABCG2基因型与治疗效果的关系

3 讨 论

HDMTX在改善ALL的治愈率方面起着重要作用。然而, MTX疗效存在很大的个体差异[3]。既往研究[8-9]中涉及MTX转运体通路的基因中有多个SNPs参与了MTX的动力学和效应，但部分结果并不明确。本研究分析ALL患儿MTX的外向转运蛋白ABCG2基因多态性与HDMTX相关毒性的关系，这些患儿均按照CCLG-ALL 2008方案接受治疗，评估ABCG2基因多态性对治疗效果的影响，结果显示,ABCG2rs2231142 SNPs与肾脏损伤发生率升高有显著相关性。这些结果与其他研究[9]报道的ABCG2rs2231142 SNPs对儿童期ALL治疗结果的影响不一致，该研究并未发现ABCG2rs2231142 SNPs与MTX毒性相关。本研究中, MTX相关毒性在维持阶段MTX剂量减少时评估，与巩固阶段相比，患儿服用的MTX剂量要低得多。目前，多项研究[9-10]调查了ABCG2基因多态性对HDMTX相关毒性的影响，但研究结果却相互矛盾，造成这种差异的可能解释是在HDMTX后服用叶酸会降低HDMTX引起的毒性增加的可能性。

HDMTX诱导的肾损伤发生在稳态血浆浓度结束时或结束后不久，其诱导肾脏损伤的可能机制包括肾小管内尿液中MTX的pH值依赖性沉淀，来自传入小动脉血管收缩的肾灌注减少，或直接毒性导致的肾小管内MTX摄取减少[11-12]。基于HDMTX诱导肾脏损伤的发生时间，在HDMTX输注前、输注中和输注后进行碱化尿液和叶酸补救均能有效预防HDMTX诱导的肾脏损伤，支持MTX沉淀在这种毒性中发挥作用的观点[13]。目前, rs2231142多态性在HDMTX相关肾脏损伤中的作用仍未完全明确，但研究[9]表明TT等位基因是HDMTX相关毒性倾向因子。本研究证实了rs2231142 TT基因型与HDMTX相关肾脏损伤发生概率增加的关联。但是，也有研究[9-10]提示并未发现rs2231137多态性与HDMTX相关毒性之间有任何关联，其原因可能是体外淋巴细胞酶的活性显示，rs2231142 TT、TC基因型酶的活性分别为野生型CC活性的70%、40%, 而rs2231137 AA基因型酶的活性约为野生型GG的30%[10]。因此, rs2231142位点变异相较于rs2231137位点变异可能使ABCG2转运能力下降更为明显，导致更多的MTX留在胞外，进而形成MTX沉淀，诱发肾脏损伤。

近年来，多项研究[9-10]调查了ABCG2基因多态性对儿童ALL生存的影响，但结果存在很多不一致。LIU S G等[9]发现rs2231142可作为ALL儿童的独立预后因素。CHANG Y H等[14]发现rs2231142与136例中国ALL患儿的复发风险无关，但T等位基因(TT+TC)患者的60个月EFS低于CC基因型患者。本研究发现具有rs2231142 T等位基因(TT+TC)型患者的72个月EFS较CC基因型患者更差[(81.5±4.6)%对比(90.2±1.8)%], 但在进一步的单变量和多变量分析中并未发现rs2231142与患儿的EFS具有相关性。此外，本研究的中位随访时间长于LIU S G等[9]、CHANG Y H等[14]研究的随访时间，理论上出现复发的例数要增多，因为复发往往发生在后期许多低风险的患者中[15]。因此，目前的结果可能表明ABCG2基因多态性不是反映ALL儿童存活的有用标志物，应进一步验证rs2231142与EFS的相关性。

本研究是一项回顾性研究，在MTX转运途径中仅选择ABCG2外向转运蛋白进行分析，没有包括其他内向和外向蛋白，并且样本量有限。考虑到上述不足，本研究最小化了临床数据收集程序的差异，因为所有患者均接受了具有可比较的CCLG-ALL 2008 治疗方案和标准化的支持性护理，并且患儿的结果评估和随访是集中进行的。此外，本研究没有因遗传异质性而产生偏差，因为所有受试者都是在具有种族同质性的地理区域招募的。当然，未来仍需要在独立队列中进一步开展前瞻性研究以确认本研究的结果。

综上所述, ALL患儿的ABCG2rs2231142基因多态性与HDMTX化疗毒副反应中肾功能损伤相关，这可能有助于指导和优化ALL患儿的MTX治疗。