二甲双胍对多囊卵巢综合征大鼠胰岛素抵抗的影响机制研究

王鸣凯, 张新化, 李 伟, 强 萍

(1. 南通大学附属医院分院 药剂科, 江苏 南通, 226001;2. 南通大学医学院 人体解剖学系, 江苏 南通, 226001;3. 江苏省南通市中医院 肾内分泌科, 江苏 南通, 226001;4. 苏州大学附属张家港医院 妇产科, 江苏 苏州, 215600)

多囊卵巢综合征(PCOS)是一种生殖异常及内分泌紊乱性疾病[1], 主要病理表现之一为胰岛素抵抗[2]。近年来研究[3]发现，慢性炎症是引起PCOS患者发生胰岛素抵抗、卵巢多囊样改变及激素分泌异常的始动因素。白细胞介素-6(IL-6)是参与炎症反应的关键因子之一，可刺激gp130使信号传导和转录激活因子(STAT)家族成员STAT3活化，介导炎症活化[4]、降解胰岛素受体底物(IRS)表达引起胰岛素抵抗的发生[5]; IL-6/STAT3通路还能通过诱导微小RNA-21(miR-21)转录表达介导雄激素的分泌[6-7], 提示调控IL-6/STAT3信号通路表达可能是治疗PCOS的潜在机制。二甲双胍为临床常用降糖药，可增强机体对胰岛素的敏感性，近年来研究[8]发现，二甲双胍对PCOS患者的临床症状有一定改善作用，但其具体分子机制尚未阐明。本研究从IL-6/STAT3通路方面探讨二甲双胍治疗PCOS的可能机制，以期为二甲双胍在PCOS领域的推广应用提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物与材料

SPF级健康雌性SD大鼠(23日龄)，购自中国医学科学院医学实验动物研究所，许可证号SCXK(京)2021-0004, 实验符合3R原则并经苏州大学附属张家港医院伦理委员会批准，批准文号为IACUC-01(20210007); 脱氢表雄酮(货号DKO124, 上海沪震实业有限公司); 二甲双胍(国药准字H20080251, 江苏德源药业股份有限公司); STAT3抑制剂Stattic(货号M00248, 北京百奥莱博科技有限公司); IL-6激活剂IL-6重组蛋白(货号HY-P7103A, 上海MCE公司); IL-6 酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(货号EK-R30201, 上海酶研生物科技有限公司); 胰岛素ELISA试剂盒(货号10-1250-01, 广州市进德生物科技有限公司); 雄激素-睾酮ELISA试剂盒(货号SND-R595, 滁州仕诺达生物科技有限公司); 苏木精-伊红(HE)染液(货号BIR615, 北京博尔西科技有限公司); 兔抗大鼠抗体IL-6(货号ab281935), STAT3(货号ab68153)，磷酸化STAT3(p-STAT3)(货号ab76315), 胰岛素受体底物-2(IRS-2)(货号ab76315), 信号转导途径抑制蛋白3(SOCS-3)(货号ab280884), 过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)(货号ab178866)，均购自美国abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 模型建立及分组: 参照文献[9]方法，于SD大鼠颈背部皮下注射脱氢表雄酮油剂60 mg/kg(大豆油溶解成30 mg/mL油剂，以2 mL/kg给药体积连续注射20 d, 1次/d)建立PCOS模型，连续2个性周期前检测阴道涂片，若阴道上皮细胞出现角化现象、动情周期不完整，视为造模成功(共50只)，随机分为模型组、二甲双胍组、STAT3抑制剂组、IL-6激活剂组、二甲双胍+IL-6激活剂组，每组10只; 另取10只大鼠于颈背部皮下注射油剂2 mL/kg, 设为假手术组。二甲双胍组参照文献[9]方法灌胃给予二甲双胍270 mg/kg(用生理盐水溶解成27 mg/mL混悬液, 10 mL/kg给药体积连续给药14 d, 1次/d); STAT3抑制剂组参照文献[10]经尾静脉注射STAT3抑制剂Stattic(500 μg/kg, 1次/2 d); IL-6激活剂组参照文献[11]经尾静脉注射重组IL-6蛋白(1 μg/kg, 1次/2 d); 二甲双胍+IL-6激活剂组给予二甲双胍的同时经尾静脉注射重组IL-6蛋白进行治疗; 模型组及假手术组给予10 mL/kg的生理盐水灌胃。所有组连续给药14 d后，进行后续试验。

1.2.2 大鼠胰岛素抵抗指数及雄激素水平检测: 各组大鼠给药结束后禁食、禁水12 h, 取腹主动脉血3 mL, 30 000转/min离心10 min后取血清，应用全自动生化分析仪检测空腹血糖水平，采用ELISA试剂盒检测雄激素睾酮、胰岛素、血清炎症因子IL-6水平，计算胰岛素抵抗指数(胰岛素抵抗指数=空腹血糖×胰岛素/22.5)。

1.2.3 HE染色法观察卵巢病理改变: 断头处死大鼠，取左右卵巢，右侧卵巢置于液氮中保存备用，左侧卵巢用4%多聚甲醛固定、梯度乙醇脱水、石蜡包埋后，制成4 μm厚度切片，取切片行HE染色后于光镜下观察。

1.2.4 免疫组化法检测卵巢组织IL-6阳性表达情况: 取左侧卵巢石蜡切片，烘烤脱蜡、梯度乙醇水化、3%过氧化氢封闭及抗原修复处理后，滴加1∶200的IL-6一抗封闭孵育过夜，与辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗室温封闭20 min, 二氨基联苯胺(DAB)显色及苏木素复染后，光镜下观察拍照，应用图像处理系统Image Pro plus 6.0检测单位面积内阳性染色的平均光密度值。

1.2.5 实时定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)法检测卵巢组织miR-21: 取右侧冰冻卵巢组织约1 g, 粉碎后匀浆处理，用Trizol试剂盒提取匀浆液中总RNA, 逆转录合成单链cDNA并以其为模板进行qRT-PCR。反应条件为94 ℃ 110 s(1个循环), 94 ℃ 20 s、55～60 ℃ 30 s、72 ℃ 60 s(45个循环), 72 ℃ 200 s(1个循环)。miR-21上游引物5′-TTGATATGTTGGATGATGGAGT-3′, 下游引物5′-TTACTCCATCATCCAACATATC-3′; 内参基因U6上游引物5′-ACACGACGGCTTCGCTC-3′, 下游引物5′-TGCGTTTAAGCACTTCGCAA-3′。采用2-△△Ct法计算miR-21相对表达量。

1.2.6 蛋白质印迹法(Western blot)检测卵巢组织蛋白表达: 取剩余右侧冰冻卵巢组织，机械粉碎匀浆后得匀浆液，提取匀浆液中蛋白，采用二喹啉甲酸(BCA)法测蛋白总浓度，取60 μg蛋白进行电泳及转膜反应操作，滴入1∶500的一抗抗体(IL-6、STAT3、p-STAT3、IRS-2、SOCS-3、PPARγ)及1∶700的β-actin内参抗体4 ℃孵育过夜，室温滴加HRP标记的羊抗兔二抗孵育40 min, 化学发光法显色、曝光，使用分析软件Alpha Ease FC扫描条带并分析条带相对灰度值。

1.3 统计学分析

2 结 果

2.1 二甲双胍对大鼠空腹血糖、胰岛素、胰岛素

抵抗指数、睾酮和IL-6水平的影响模型组大鼠空腹血糖、胰岛素、胰岛素抵抗指数、睾酮和IL-6水平均高于假手术组，差异有统计学意义(P<0.05); 二甲双胍组、STAT3抑制剂组大鼠空腹血糖、胰岛素、胰岛素抵抗指数、睾酮和IL-6水平均低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05); IL-6激活剂组大鼠空腹血糖、胰岛素、胰岛素抵抗指数、睾酮和IL-6水平均高于模型组、二甲双胍组，差异有统计学意义(P<0.05); 二甲双胍+IL-6激活剂组大鼠空腹血糖、胰岛素、胰岛素抵抗指数、睾酮和IL-6水平均高于二甲双胍组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠空腹血糖、胰岛素、胰岛素抵抗指数、睾酮和IL-6水平比较

2.2 二甲双胍对大鼠卵巢组织病理形态的影响

假手术组大鼠卵巢组织卵泡及黄体结构正常，无病变; 模型组卵巢组织可见闭锁卵泡及无卵丘的囊性滤泡增多，卵母细胞放射冠消失，颗粒细胞层减少，黄体萎缩明显; 二甲双胍组和STAT3抑制剂组大鼠卵泡逐渐恢复正常，囊性滤泡数量减少，卵母细胞放射冠逐渐清晰，黄体及颗粒细胞层增多; IL-6激活剂组大鼠囊性卵泡增多，卵巢颗粒细胞层减少，黄体减少及消失严重; 二甲双胍+IL-6激活剂组上述病理损伤较二甲双胍组严重。见图1。

图1 各组大鼠卵巢组织HE染色图(放大倍数100倍)

2.3 二甲双胍对大鼠卵巢组织IL-6阳性表达的影响

假手术组大鼠卵巢组织中IL-6呈弱阳性表达; 模型组大鼠卵巢组织卵泡上皮细胞、颗粒细胞层中IL-6呈强阳性表达, IL-6阳性表达强于假手术组，差异有统计学意义(P<0.05); 与模型组相比，二甲双胍组、STAT3抑制剂组大鼠IL-6阳性表达降低，差异有统计学意义(P<0.05); IL-6激活剂组大鼠IL-6阳性表达高于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。二甲双胍+IL-6激活剂组IL-6阳性表达高于二甲双胍组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2、表2。

图2 各组大鼠卵巢组织IL-6免疫组化染色图(放大倍数100倍)

表2 各组大鼠卵巢组织IL-6阳性表达比较

2.4 二甲双胍对大鼠卵巢组织miR-21表达的影响

模型组大鼠卵巢组织miR-21表达高于假手术组，差异有统计学意义(P<0.05); 二甲双胍组、STAT3抑制剂组大鼠miR-21表达低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05); IL-6激活剂组大鼠miR-21表达高于模型组、二甲双胍组，差异有统计学意义(P<0.05)。二甲双胍+IL-6激活剂组miR-21表达高于二甲双胍组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠组织miR-21表达比较

2.5 二甲双胍对大鼠IL-6、p-STAT3/STAT3、IRS-2、SOCS-3和PPARγ蛋白表达的影响

与假手术组相比，模型组大鼠IL-6、p-STAT3/STAT3、SOCS-3蛋白表达升高, IRS-2、PPARγ蛋白表达降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比，二甲双胍组和STAT3抑制剂组大鼠IL-6、p-STAT3/STAT3、SOCS-3蛋白表达降低, IRS-2、PPARγ蛋白表达升高，差异有统计学意义(P<0.05); IL-6激活剂组大鼠IL-6、p-STAT3/STAT3、SOCS-3蛋白表达高于模型组、二甲双胍组, IRS-2、PPARγ蛋白表达低于模型组、二甲双胍组，差异有统计学意义(P<0.05)。二甲双胍+IL-6激活剂组IL-6、p-STAT3/STAT3、SOCS-3蛋白表达高于二甲双胍组, IRS-2、PPARγ蛋白表达低于二甲双胍组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3、表4。

A: 假手术组; B: 模型组; C: 二甲双胍组; D: STAT3抑制剂组; E: IL-6激活剂组; F: 二甲双胍+IL-6激活剂组。图3 各组大鼠卵巢组织IL-6、p-STAT3/STAT3、SOCS-3、IRS-2和PPARγ蛋白Western blot结果

表4 各组大鼠卵巢组织IL-6、p-STAT3/STAT3、SOCS-3、IRS-2、PPARγ蛋白表达比较

3 讨 论

胰岛素抵抗与高雄激素血症可相互关联，促进PCOS发展。相关研究[12]证实，胰岛素分泌过多，一方面可使卵巢间质、卵泡膜细胞、颗粒细胞合成雄激素相关酶的活性升高而大量分泌雄激素，另一方面可干扰肝脏合成性激素结合球蛋白，引起雄激素游离睾酮水平升高。较高水平的雄激素不仅会促进胰岛素水平增高，还会促进颗粒细胞迅速黄素化、小窦卵泡发育停止而影响卵泡的发育及成熟，导致PCOS患者排卵功能异常[13]。戚怀钻[14]发现, PCOS患者胰岛素抵抗指数及雄激素水平均显著高于假手术组，且胰岛素抵抗指数与雄激素水平存在一定相关性。研究[15]发现，减轻胰岛素抵抗，可改善PCOS患者雄激素水平分泌过高，缓解卵巢形态改变。二甲双胍可增强组织细胞对胰岛素的敏感性，缓解PCOS症状。临床研究[16-17]发现, PCOS患者口服二甲双胍，可改善子宫内膜形态，并缓解激素分泌及代谢紊乱，证实了二甲双胍在治疗PCOS方面有潜在应用价值。本研究也发现，给予PCOS大鼠二甲双胍治疗后，大鼠胰岛素抵抗指数下降，雄激素水平趋于正常，卵巢组织闭锁卵泡增多、颗粒细胞减少及黄体萎缩等病理损伤缓解，证实二甲双胍可改善PCOS胰岛素抵抗、雄激素分泌增多及卵巢形态改变等病理症状，但其具体作用机制还不甚明确。

炎症反应可损伤胰岛细胞，进而损伤卵巢，导致卵巢囊性改变及激素分泌异常，已受到PCOS研究者的重视[18]。近年来有研究[19]认为PCOS是一种亚临床炎症性疾病, PCOS患者血清炎症因子如IL-6等水平与胰岛素抵抗指数呈正比，并认为炎症反应是引起PCOS患者胰岛素抵抗及雄激素分泌水平升高的始动因素。IL-6/STAT3通路是介导炎症反应、胰岛素抵抗、雄激素分泌增加的关键通路。研究[20]证实, IL-6可通过激活Janus激酶，刺激STAT3磷酸化活化，活化的STAT3可引起M2型巨噬细胞特异性因子PPARγ减少而减弱抗炎反应，导致炎症反应活化。SOCS-3可通过降解IRS-2阻断胰岛素通路过程中的糖原合成及吸收，降低肝脏及组织细胞对胰岛素的敏感性，诱导胰岛素抵抗的发生，而IL-6/STAT3活化可增加SOCS-3的表达[21], 提示IL-6/STAT3可通过促进SOCS-3活化来介导胰岛素抵抗的发生。雄激素受体可直接介导miR-21的启动子区域而促进miR-21表达, miR-21高表达可促进睾丸去势大鼠睾丸非依赖性生长[6], 有研究[7]发现IL-6/STAT3通路活化或抑制能引起miR-21表达的上调或下调，提示IL-6/STAT3通路活化可能通过促进miR-21表达来诱导雌激素分泌。ZHANG Y L等[22]研究发现, PCOS模型大鼠血浆中IL-6/STAT3及miR-21表达均处于活化状态。本研究发现, IL-6在PCOS大鼠血清及卵巢组织中的表达均异常升高，用IL-6激活剂促进IL-6表达后, STAT3及SOCS-3、miR-21表达也进一步升高，且大鼠胰岛素抵抗、雄激素分泌升高及卵巢病理改变进一步加重，反之抑制STAT3活化后, IL-6及SOCS-3、miR-21表达均显著降低，大鼠胰岛素抵抗、雄激素分泌升高及卵巢病理改变均显著缓解，提示IL-6/STAT3通路活化可能参与PCOS胰岛素抵抗、雄激素分泌及卵巢形态病理改变过程。相关研究[23]报道，二甲双胍可通过下调IL-6/STAT3通路活化来抵抗卵巢癌细胞恶性增殖，提示二甲双胍可通过干预IL-6/STAT3通路改善卵巢恶性病变。本研究发现，采用二甲双胍治疗PCOS大鼠后，大鼠卵巢组织中IL-6/STAT3信号通路处于抑制状态, IL-6/STAT3信号通路下游与胰岛素抵抗、雄激素分泌相关的因子SOCS-3、miR-21表达显著降低, PPARγ、IRS-2表达显著升高，提示二甲双胍治疗PCOS可能与抑制IL-6/STAT3信号通路活化有关。本研究还发现, IL-6激活剂可显著削弱二甲双胍抑制IL-6/STAT3活化、改善PCOS病理症状的作用。

综上所述，二甲双胍可通过抑制IL-6/STAT3活化而改善PCOS大鼠胰岛素抵抗、雄激素分泌及卵巢形态改变，为阐明二甲双胍治疗PCOS的具体机制提供了一定参考。但IL-6/STAT3通路参与胰岛素抵抗、雄激素分泌的靶基因调控机制还存在许多盲点，未来有待进一步探讨。