三七总皂苷结合细胞穿透肽Tat经皮给药促进骨折愈合的研究*

蒋 擎 陈晓超 田康勇 谢超春 刘腾鸿 林燕云 游纯秋

1 福建省福州市中医院骨科 350001； 2 福州大学生物科学与工程学院； 3 山东威高骨科材料股份有限公司

骨折作为临床工作中的常见病、多发病，如何加速其愈合进程，提高其愈合质量，成为骨科医师一直密切关注的重大课题之一[1]。近年来随着研究的不断深入，研究人员从临床观察及实验室研究[2-5]均证实药物外治法对骨折愈合有明显优势，与此同时如何提高外用药透皮吸收效率，进而提高外用药在骨折病灶局部的有效浓度是目前研究热点。前期研究[6]证实药物在融合有Tat短肽后可增强透皮吸收效果，故本研究拟采用三七的主要有效成分三七总皂苷(Panax notoginseng saponins,PNS)结合细胞穿透肽Tat(47-57)进行联合外用给药，尝试提高PNS的透皮吸收效率，进而使其在骨折病灶局部达到有效的治疗浓度，观察PNS在细胞穿透肽Tat的协助下是否能够促进骨折病灶部位的加速愈合。

1 材料与方法

1.1 材料 (1)药品：动物实验所需的各种外用霜膏剂委托宁波睿晅生物科技有限公司生产，三七总皂苷(纯度80%)购自西安百川生物科技有限公司，短肽Tat(47-57)上海淘普生物科技有限公司合成，其他各种化学试剂均购自国药集团化学试剂有限公司。(2)实验动物：SD雄性大鼠40只，体重在300～340g之间。

1.2 方法

1.2.1 骨折SD雄性大鼠模型的建立：将40只大鼠适应性饲养3d后进行造模。具体方法如下：将大鼠以仰卧位固定于操作台上，右下肢小腿备皮、碘伏消毒后，用血管钳钝性折断大鼠右下肢胫骨，不做固定。

1.2.2 分组及用药：实验动物成功建模后，将大鼠随机分为四组：空白对照组、外用三七总皂苷组(PNS外用组)、外用三七总皂苷和细胞穿透肽联合组(Tat-PNS外用组)、口服三七总皂苷组(PNS口服组)，每组10只。根据不同分组进行给药：(1)Tat-PNS外用组：Tat-PNS外用(其中PNS浓度为1%W/V，Tat浓度为0.05%W/V)，经皮给药量3g/次，2次/d。(2)PNS外用组：PNS外用(其中PNS浓度为1% W/V)，经皮给药量3g/次，2次/d，给药方式与Tat-PNS外用组一致。(3)PNS口服组：PNS口服(其中PNS浓度0.1g，纯度80%)，0.10g/次，2次/d。(4)空白对照组不予上述药物治疗。给药为期14d，实验期间各组动物均予基础饲料饲养。

1.3 分析实验方法

1.3.1 皮肤组织抗氧化能力SOD水平测定。称取约0.10g右下肢小腿组织，加入1ml提取液，进行冰浴匀浆；转速8 000r/min、4℃离心10min，取上清，置冰上待测。SOD酶活力采用邻苯三酚自氧化方法测定，具体操作按照南京建成生物工程研究所SOD试剂盒操作手册进行实验。

1.3.2 病灶组织取样。于手术后2周以断颈法处死大鼠，自膝关节处将双小腿离断，去除小腿皮肤及软组织备用，将胫腓骨联台取出，用10%福尔马林溶液固定1周，分离出胫骨，以原骨折处和缺损处为中心取胫骨段10mm，做组织学切片(纵切)，以备免疫组化染色观察。

1.3.3 实验动物骨折处骨形态发生蛋白-2(BMP-2)免疫组织化学染色。(1)石蜡切片制作：将实验动物骨折处新鲜组织用固定液固定24h以上。将组织从固定液取出在通风橱内用手术刀将目的部位组织修平整，将修切好的组织和对应的标签放于脱水盒内。将脱水盒放进脱水机内依次梯度酒精进行脱水，随后进行石蜡包埋。将浸好蜡的组织于包埋机内进行包埋。先将融化的蜡放入包埋框，待蜡凝固之前将组织从脱水盒内取出按照包埋面的要求放入包埋框并贴上对应的标签。于-20°冻台冷却，蜡凝固后将蜡块从包埋框中取出并修整蜡块。将修整好的蜡块，放入-20℃冻台冷却，再将冷却的蜡块置于石蜡切片机切片，厚4μm。切片漂浮于摊片机40℃温水上将组织展平，载玻片将组织捞起，60℃烘箱内烤片。水烤干、蜡烤化后取出常温保存备用。(2)BMP-2免疫组化测定：切片放入切片架内，60℃烘箱内烤60～90min。经过脱蜡处理后，进行抗原修复步骤。组化盒内加入2/3的1×柠檬酸溶液，并提前放入微波炉加热至沸腾。切片放入组化盒盖上盖子小火微沸1min，取出室温静置5min，微沸4次后，盖上湿布冷却至室温。用PBS清洗轻轻震荡数次后，于室温放置8min。添加内源性过氧化物酶阻断剂，室温孵育10min。随后滴加5%BSA，室温下封闭孵育20min后，甩去并擦干多余液体。滴加一抗(提前用5%BSA稀释)，置于湿盒内4℃冰箱过夜，对照组阳性/阴性滴加BSA孵育过夜。12h后，37℃水浴锅或烘箱内复温30min，PBS冲洗3次，2min/次。随后进行二抗孵育：滴加HRP酶标二抗(这是生物素标记的二抗，所以需要第三步，PBS稀释)，37℃孵育30min，PBS洗5次，5min/次。滴加试剂SABC[辣根过氧化物酶标记HRP-Streptavidin,1∶(200～400)PBS稀释]，37℃孵育30min，PBS洗4次，5min/次。甩去PBS缓冲液，滴加DAB显色液，显微镜下观察直到样本组织被染成深褐色(且阴性样本不出现颜色)，立即用ddH2O冲洗终止染色，并记录染色时间。染色后甩干表面ddH2O，滴加苏木素，染色3min，自来水洗去苏木素；分化液(G1039)分化约3s，自来水洗；返蓝液(G1040)返蓝约3s，至出现较蓝颜色为止，自来水洗。用梯度酒精浸泡脱水，自然风干或反面吹干。最后将切片水平放置于切片版上，在样本中间滴加中性树脂进行封片，倾斜盖上盖玻片，排出气泡。镜检拍照分析BMP-2在切片中的表达。

2 结果

2.1 不同给药组对实验动物骨折处皮肤组织抗氧化能力SOD水平的影响 四组SOD活性比较：Tat-PNS外用组(40.23±11.29)U/mg、PNS口服组(30.36±7.32)U/mg、PNS外用组(28.23±6.34)U/mg明显高于空白对照组(19.23±2.39)U/mg(P<0.05)，其中Tat-PNS外用组、PNS口服组SOD活性均高于PNS外用组(P<0.05)，与PNS口服组相比，Tat-PNS外用组SOD活性明显提高(P<0.01)。

2.2 不同给药组对实验动物骨折处骨形态发生蛋白BMP-2表达水平的影响 骨折后第2周，各给药组骨折处组织切片BMP-2表达水平结果显示，空白对照组BMP-2的表达水平最低，基本未见阳性细胞。PNS口服组和普通PNS外用组中可见少量的阳性细胞，表明普通外用给药和口服给药可以促进并上调BMP-2在病灶组织中的表达。而着色最深的实验组是Tat-PNS外用组，骨痂组织中成纤维细胞、成骨细胞、成软骨细胞、软骨细胞和类骨质中的骨细胞胞浆中，均可见明显的BMP-2表达的棕黄色产物。具体见图1。

3 讨论

在祖国医学中，三七具有止血、化瘀、止痛的药理作用，很早便被人们广泛应用于各种骨伤疾病的治疗中，具有良好的临床功效，其中，PNS是三七的主要有效成分，其使用方法主要是口服，但药物口服，无法避免肝脏的首过效应，导致药物的生物利用度降低，同时还存在胃肠蠕动及胃肠酸碱的减效作用。但经皮给药方式亦存在技术难点——如何保证有效分子的高效透皮吸收，在尽可能保障中药透皮制剂吸收速率提高的同时，最大限度降低透皮制剂皮肤刺激性。近年来其发展迅速，再与新型经皮给药剂型相结合，联合促进中药经皮吸收。

近年来细胞穿透肽(Cell penetrating peptide，CPP)的主动跨膜递送作用的发现和应用研究为传统药物的透皮吸收瓶颈问题带来了希望。CPP是一类具有跨膜递送生物大分子进入细胞能力的短肽，被广泛认为是最有希望和应用前景的经皮给药递送方式[7]。细胞穿透肽能够输送不同种类的生物分子进入细胞内部；某些短肽甚至具备突破血脑屏障、血睾屏障和胎盘屏障的能力[8]。自1988年首次发现来源于人免疫缺陷病毒中的HIV-Tat蛋白具有主动跨膜功能以来[9]，利用细胞穿透肽作为细胞内药物递送载体，已经成功将不同物理尺寸大小的生物分子高效递送进入细胞内部，从寡核苷酸、DNA、反义RNA，到短肽、蛋白质，甚至是磁性纳米颗粒和微米级的脂质体[10]。其中Tat(47-57)是细胞穿透肽中研究时间最长、研究最透彻、应用范围最广的一种细胞穿透肽[11]。鉴于Tat对生物大分子的高效跨膜递送作用，以及蛋白质等生物大分子非常难以进入皮肤，即使通过离子导入、超声波引导等方法也只能少部分进入的现实问题，一些学者研究了Tat在药物的透皮吸收方面的应用，这其中包括Tat在抗风湿性关节炎药物的透皮吸收方面的应用研究。例如，Mi Z等报道了一个关节滑膜特异性的Tat及其透皮递送细胞凋亡试剂进入滑膜，从而治疗风湿性关节炎相关的滑膜组织增生[12]。这些结果提示我们，Tat的跨膜递送作用有望促使局部涂抹的SOD分子到达关节病灶组织。总之，Tat有望解决用于治疗骨性疾病的药物透皮吸收难题，最大化促进药物分子有效到达关节病灶组织，并促使药物分子跨膜进入细胞内部。

本研究动物实验结果显示：细胞穿透肽Tat可以明显提高目标药物PNS的透皮吸收效率，从而导致PNS在骨折病灶部位的高浓度富集；Tat短肽促进PNS在病灶组织附近的高度富集，进而明显增加病灶局部的皮肤上抗氧化活性，皮肤组织SOD水平得到显著提升(P<0.05)，Tat-PNS外用组其病灶部位药物吸收效果明显优于普通外用PNS及空白对照组，而且能够与PNS口服组基本持平；此BMP-2可通过上调破骨细胞的数量及活性，从而促进板层骨的提前形成，并诱导髓腔再通，而新生连接骨皮髓腔的再生被视为骨折愈合的标志，由此有研究人员[13-14]提出BMP-2的浓度可一定程度显示骨折病灶的愈合程度，二者具有正相关性。本研究结果显示Tat-PNS外用组中BMP-2阳性表达细胞数明显高于普通外用PNS及空白对照组，并最终在实验动物模型中表现出比普通PNS外用组和PNS口服组更好的骨折修复效果。

总之，本研究中各项实验数据表明，细胞穿透肽Tat可以改善三七总皂苷PNS透皮吸收能力，大幅度改善PNS经皮给药的生物利用度，本研究为三七总皂苷大面积的临床实验及更深入的科学研究提供相应的基础数据参考。