QuEChERs-同位素内标—气相色谱—串联质谱法快速测定茶叶中4种糠醛类物质

刘粲迪 陈 波 尹芳平 曾 辉

(1. 化学生物学及中药分析教育部重点实验室，湖南 长沙 410081；2. 植化单体开发与利用湖南省重点实验室，湖南 长沙 410081；3. 湖南师范大学，湖南 长沙 410081；4. 长沙市食品药品检验所，湖南 长沙 410016；5. 国家酒类产品质量检验检测中心〔湖南〕，湖南 长沙 410016)

糠醛、5-甲基糠醛、5-羟甲基糠醛和2-乙酰呋喃均为糠醛类化合物，属于具有特殊风味的物质，广泛存在于各类食品当中[1]。糠醛类物质的生成途径主要有两条：① 葡萄糖、果糖在酸性条件下脱水生成5-羟甲基糠醛，其经过水解生成各糠醛类物质，即糖的热降解反应；② 氨基化合物与羰基化合物之间发生的非酶促反应(美拉德反应)，即还原糖的羰基和氨基酸中的自由基缩合生成席夫碱，后经重排生成Amadori产物，再生成5-羟甲基糠醛，后转化为糠醛类物质[2-3]。5-羟甲基糠醛有一定神经毒性，经呼吸道或皮肤途径可被人体吸收，对呼吸道、皮肤、黏膜等具有刺激性，对人体内脏会产生损害，过量摄入甚至可能致癌变[4]。

茶叶，由茶树的叶或芽加工而成，富含糖类、黄酮类、氨基酸等多种化学成分[5-6]，部分化学成分使得茶叶具有延缓衰老、抗氧化、降血脂等保健作用[7-9]。茶叶品种繁多，分类方法也很多，如按照发酵程度不同可以分为非发酵茶、部分发酵茶、完全发酵茶和后发酵茶，分类区别在于其有着不同的加工方法，而热处理是茶叶加工中必不可少的环节之一，因此伴随着不同程度的美拉德反应发生，能给茶叶带来独特的香气和滋味，生成糠醛类物质；茶叶中含有的糖类成分较多[10]，在生产与贮藏环节中发生糖的热降解反应也可能产生糠醛类物质。目前仅有GH/T 18796—2012《蜂蜜》规定蜂蜜中5-羟甲基糠醛的限量为40 mg/kg，其他产品包括茶叶对糠醛类物质均无限量要求[11]，对茶叶中糠醛类物质的已有研究也较少，鉴于糠醛类物质对人体的毒性作用及其在茶叶中的存在情况，研究建立一种能快速准确地测定茶叶中糠醛类物质的分析方法十分必要。

糠醛类物质的检测方法主要有高效液相色谱法[12]、气相色谱法[13]、气相色谱—质谱法[3]和高效液相色谱—串联质谱法[14]。由于糠醛类物质检测波长较小，茶叶基质中有较多物质在低波长下有吸收，采用HPLC法时基线干扰较大；GC的灵敏度较低，特异性不高，难以满足茶叶中的糠醛类物质检测要求；部分糠醛物质极性较低，在HPLC-MS/MS法常用的ESI源下较难离子化，需采用灵敏度较高、特异性强的GC-MS/MS法进行检测。由于茶叶基质较复杂，前处理方法选择很关键。茶叶基质常用的前处理方法有固相萃取法[15]、液液萃取法[16]、基质分散萃取法[17]等，这些方法通常需要进行多次净化处理，操作较为繁琐、耗时且成本较为高昂。QuEChERs法是结合了固相萃取及基质固相分散的一种新型前处理方法，该法通常使用乙腈或酸化乙腈作为溶剂进行提取，加入除水试剂(无水硫酸镁等)进行除水，再用一定量的N-丙基乙二胺、石墨化炭黑和十八烷基硅烷等将提取液进一步净化，除去提取液中的共萃基质如糖类、色素、蛋白质等，减少基质效应的作用[18]。研究拟根据糠醛类物质的理化性质，以乙腈提取茶叶样品，使用十八烷基硅烷及石墨化炭黑进行QuEChERs法净化后，采用同位素内标-GC-MS/MS法对茶叶中的糠醛类物质进行分析检测，建立一种测定茶叶中糠醛类物质的分析方法，以期为茶叶中糠醛类物质含量测定及质量监控提供方法依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

糠醛、2-乙酰呋喃：纯度≥99%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

糠醛-D4：纯度≥99.8%，北京振翔科技有限公司；

5-甲基糠醛：纯度≥98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

5-羟甲基糠醛：纯度≥99.5%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

石墨化炭黑(Carb)、十八烷基硅烷(C18)、N-丙基乙二胺(PSA)：上海迪马科技有限公司；

无水硫酸镁：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

乙腈、甲醇：色谱级，德国默克公司；

茶叶样品：共52种，生产日期大多数在2020年9月，按茶叶品种分类有绿茶、红茶、黄茶、白茶、乌龙茶、黑茶6种，涵盖了不发酵茶、部分发酵茶、完全发酵茶和后发酵茶，网购。

1.1.2 仪器与设备

气相色谱—串联质谱联用仪：GCMS-TQ8050NX型，日本岛津公司；

圆周振荡器：IKA MS3型，德国艾卡公司；

超纯水仪：Milli-Q型，德国默克密理博公司；

超声波清洗器：AS3120型，天津奥特赛恩斯仪器有限公司；

十万分之一天平：X205DU型，梅特勒—托利多国际贸易有限公司；

振荡器：EDAA-HM-01型，上海安谱实验科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 标准溶液的配制 用分析天平分别准确称取5-羟甲基糠醛、糠醛、5-甲基糠醛、2-乙酰呋喃各20.00 mg于20 mL容量瓶中，用甲醇定容，分别得到1 000 μg/mL的标准品储备溶液，于-20 ℃冰箱保存。用移液管分别移取400 μL上述标准溶液至20 mL容量瓶，以乙腈定容，配制得到质量浓度为20 μg/mL的中间混合标准储备溶液。用分析天平准确称取糠醛-D415.00 mg于20 mL容量瓶中，用甲醇定容，得到质量浓度为750 μg/mL的标准储备溶液，于-20 ℃冰箱保存。用移液管移取200 μL上述溶液至20 mL容量瓶，用乙腈(色谱级)定容，得到质量浓度为7.5 μg/mL的中间标准储备溶液。

将中间混合标准储备溶液用乙腈进行稀释，配制成1.25，2.50，5.00，10.00，20.00，50.00，200.00 μg/L的混合标准系列溶液，每个梯度浓度含有12 μg/L的糠醛-D4溶液作为内标。

将中间混合标准储备溶液用处理后的茶叶样品溶液进行稀释(样品处理方法见1.2.2)，配制成1.25，2.50，5.00，10.00，20.00，50.00，200.00 μg/L的基质配标系列溶液。

1.2.2 样品前处理 将所有茶叶样品用粉碎机粉碎后，过筛，称取2 g样品粉末于50 mL离心管内，加入40 μL 7.5 mg/mL糠醛-D4溶液，加入25 mL乙腈，于摇床上2 500 r/min 震荡3 min，于超声波清洗器中500 W功率超声30 min，静置1 min后取上清液1 mL至10 mL 塑料离心管中(管内装有50 mg C18，20 mg Carb)，涡旋2 min后，10 000 r/min离心5 min，取上清液过0.22 μm有机相滤膜后，待测。

1.2.3 GC-MS/MS分析

(1) 气相条件：色谱柱为Shimadzu SH-RTX-WAX(30 m×0.25 mm×0.25 μm)弹性石英毛细管柱；载气He(99.999%)，碰撞气Ar；进样口温度250 ℃，不分流进样；线速度控制，柱流量1.00 mL/min。程序升温程序：初始柱温箱温度50 ℃，保持2 min，以15 ℃/min升至230 ℃，保持10 min。

(2) 质谱条件：离子源为EI源；离子源温度230 ℃，电子能量70 eV，检测器电压1.4 kV，溶剂延迟时间3.5 min；多反应检测模式(MRM)。取2 μg/mL 混合标准溶液1.0 μL注入气相色谱—串联质谱仪进行分析，得到目标物质谱图。进行MRM参数自动优化，得到目标分析物选择的母离子、子离子、碰撞能量及对应的保留时间。

位于郝关与同口之间，口门长500m。闸基高程2～8.5m主要为第②层壤土、第②2层砂壤土。壤土具有中等压缩性，微弱透水性，强度较高，构成地基主要持力层；高程2m以下为第③壤土，含大量腐殖质和贝壳、螺壳碎屑，局部呈淤泥质，工程性质相对较差。

2 结果与讨论

2.1 试验条件的优化

2.1.1 样品前处理条件的优化 茶叶的基质非常复杂，含有色素、矿物质、糖类物质等。QuEChERs法是最常用的净化手段之一[19]，选用合适的吸附盐配比能有效降低茶叶中的杂质干扰。该法常用的吸附盐有十八烷基硅烷(C18)、N-丙基乙二胺(PSA)、石墨化炭黑(Carb)和无水硫酸镁。C18属于非极性吸附剂，可以吸附极性化合物中的非极性化合物，如一些长链的脂肪类化合物；PSA有一定的极性相互作用和阴离子交换作用，可以去除非极性化合物中的极性化合物，如一些脂肪酸、有机酸类；Carb主要用来除去待测样品中的色素；无水硫酸镁主要用来除去样品基质中的水分。以不同配比的C18+PSA组合萃取盐对100 μg/mL混合标准溶液进行处理后进样分析，对比未经过处理的100 μg/mL混合标准溶液，以期考察各萃取盐对目标物是否有吸附，其回收率见表1。

由表1可知，PSA对糠醛、5-甲基糠醛和5-羟甲基糠醛有较高的吸附，导致回收率偏低，而C18对目标物均无吸附，各目标物的回收率接近100%，故选择50 mg C18作为QuEChERs吸附盐之一，设计C18及Carb的配比组合，按同样方法进行试验，结果见表2。

表1 C18与PSA配比对4种糠醛类物质回收率的影响Table 1 Recovery results of four furfurals under different ratios of C18 and PSA %

由表2可知，随着Carb用量增加，目标物的回收率逐渐降低，尤其是对5-羟甲基糠醛的回收率影响较大，当采用50 mg C18+30 mg Carb时，其回收率仅为73.29%。

表2 C18与Carb配比对4种糠醛类物质回收率的影响Table 2 Recovery results of four furfurals under C18 and different amounts of Carb %

但是Carb萃取盐有良好的除色素能力，综合考虑回收率和除杂能力，选择50 mg C18+20 mg Carb的组合萃取盐。

此外，为考察无水硫酸镁对目标物回收率的影响，在实际茶叶样品中加入50 μg/mL混合标准溶液，后经过QuEChERs处理后进行分析。结果表明，无水硫酸镁添加与否并不影响目标物的回收率。为简化试验步骤和节约成本，选择50 mg C18+20 mg Carb作为QuEChERs用萃取盐。

2.1.2 气相色谱柱的选择 分别选择了SH-I-5SiL、SH-Rtx-wax、InertCap 1701MS 3种不同极性的色谱柱进行对比。结果表明，SH-I-5SiL、InertCap 1701MS色谱柱在相同的气相条件下，5种目标物的保留时间较短，可以在一定程度上减少分析时间，但由于5-羟甲基糠醛的极性较大，在这两款色谱柱上拖尾较严重，无法准确定量。而采用SH-Rtx-wax柱进行分析时，5-羟甲基糠醛色谱峰形尖锐，拖尾因子更接近于1(见表3)，其余4种目标物色谱峰形均较好。因此，选择SH-Rtx-wax柱来分离分析糠醛类物质，5种物质在SH-Rtx-wax柱上的MRM色谱图见图1。

图1 5种物质在Wax柱上的TIC图Figure 1 TIC diagram on wax column of 5 substances

表3 3种气相色谱柱的柱性能表(5-羟甲基糠醛)Table 3 Column performance three gas chromatographic columns (5-hydroxymethylfurfural)

2.1.3 GC-MS/MS条件的优化 通过进单一标准品确定糠醛、糠醛-D4、5-甲基糠醛、2-乙酰呋喃、5-羟甲基糠醛的质谱图及出峰顺序。根据质谱图的相对丰度大小，选取目标化合物的母离子，取2 μg/mL混合标准溶液1.0 μL 注入气相色谱—串联质谱仪进行分析扫描，并以5 V 为间隔，在5～45 V的范围内优化碰撞能量，得到最佳的离子对作为定量离子对，优化后的MRM参数见表4。5种物质的质谱图见图2～图6。

图2 糠醛的质谱图Figure 2 Mass spectrum of furfural

图3 糠醛-D4的质谱图Figure 3 Mass spectrum of furfural-D4

图4 2-乙酰呋喃的质谱图Figure 4 Mass spectrum of 2-acetylfuran

图5 5-甲基糠醛的质谱图Figure 5 Mass spectrum of 5-methylfurfural

图6 5-羟甲基糠醛的质谱图Figure 6 Mass spectrum of 5-hydroxymethyl furfural

表4 5种目标物的MRM参数Table 4 MRM parameters of 5 targets

2.2 基质效应的考察

基质效应普遍存在于化学分析中，忽略基质效应的影响可能会导致样品测定得到的含量水平与真实值存在很大的偏差。常规的基质效应消除方法有两种：① 通过配制基质匹配线性标准溶液来对目标物进行定量；② 通过加入已知量的标准品至样品提取液中，利用待测目标物和标准品响应的比值进行定量[20]11-12。基质效应的计算公式如下：

(1)

M——基质效应的大小；

KM——基质配标标准曲线方程的斜率；

KS——溶剂配标标准曲线方程的斜率。

当M的绝对值为0%～25%时，说明待测目标物在样品中有弱基质效应，当M的绝对值为25%～50%时，说明待测目标物具有中等基质效应，当M的绝对值大于50%时，说明待测目标物的基质效应比较显著[20]9-10。通过建立基质匹配标准曲线方程、标准溶液线性标准方程，计算M来评估4种糠醛类物质在茶叶基质中的基质效应，结果表明，糠醛、2-乙酰呋喃、5-羟甲基糠醛在茶叶溶液中具有弱基质效应，5-甲基糠醛在茶叶溶液中有较强的基质效应。采用基质匹配标准溶液操作相对较复杂，为了得到可靠的结果，采用糠醛-D4作为内标物，使用内标法进行定量。

2.3 检测限和定量限

将5 μg/L混合标准溶液逐级稀释，取稀释后的溶液注入气相色谱—串联质谱仪进行检测，以信噪比(S/N)≥3为检出限，信噪比(S/N)≥10为定量限，得出方法的检出限为1 μg/kg (n=3)，定量限为4.125 μg/kg (n=3)。

2.4 标准曲线及线性范围

配制1.25，2.50，5.00，10.00，20.00，50.00，200.00 μg/L系列质量浓度的糠醛、2-乙酰呋喃、5-甲基糠醛、5-羟甲基糠醛混合标准溶液(每个质量浓度点含有12 μg/L的糠醛-D4作为内标)进行测定，以质量浓度比(目标物/内标)为横坐标，以峰面积比(目标物/内标)为纵坐标绘制标准工作曲线，4种目标物及内标物的总离子流图见图1。4种糠醛类物质的线性回归方程及相关系数见表5。

表5 4种糠醛类物质的线性范围、线性回归方程及相关系数Table 5 Linear range,linear regression equation and correlation coefficient of four furfural compounds

2.5 回收率与精密度

称取21份茶叶样品，其中18份分别添加低、中、高3个浓度的标准溶液，另外3份样品不添加标准溶液，按试验方法处理后同时测定糠醛类物质的含量，结果见表6。由表6可知，测得回收率范围在89.10%～113.02%，相对标准偏差在10%以内，方法的准确度与精密度符合检测要求[21]。

表6 4种糠醛类物质低、中、高3水平加标回收率及RSDTable 6 Recoveries and RSD of four furfurals at low,medium and high levels (n=6)

以高水平加标样品溶液为考察对象，在进行加标处理后的0，2，4，8，12，24 h分别进样，考察方法的日内精密度，连续3 d进样考察日间精密度，结果见表7。结果表明，方法的日内精密度和日间精密度均小于12%，符合检测的要求。

表7 4种糠醛类物质的日内精密度和日间精密度Table 7 Diurnal and diurnal precision of four furfural comounds %

2.6 实际样品的测定

采用试验建立的QuEChERs-同位素内标—气相色谱—串联质谱法对收集到的52种茶叶样品进行分析，结果表明，大部分茶叶样品中均检出糠醛、2-乙酰呋喃、5-甲基糠醛、5-羟甲基糠醛。大部分茶叶中糠醛类物质含量小于0.10 mg/kg，少部分茶叶的糠醛类物质含量分布在0.10～1.25 mg/kg，5-羟甲基糠醛含量在糠醛类物质中相对较高，部分含量超过了1.25 mg/kg，最高的检出值达到了6.44 mg/kg，为一种乌龙茶。结果表明，糠醛类物质在茶叶中可检出，可能存在一定的安全隐患。

表8 茶叶样品中4种糠醛类物质的检出量分布范围Table 8 Detection amount and distribution range of four furfurals in tea samples

3 结论

通过对质谱参数、气相色谱条件、前处理方法的优化，建立了一种QuEChERs-同位素内标-GC-MS/MS法检测茶叶中的糠醛、2-乙酰呋喃、5-甲基糠醛、5-羟甲基糠醛4种糠醛类物质的分析方法。方法在1.25～200.00 μg/L的质量浓度范围内均呈良好的线性关系(R2≥0.999 0)；该方法加标样品的回收率为89.10%～113.02%，准确度高。采用该方法对收集的茶叶样品进行测定，大部分茶叶样品中均检出糠醛、2-乙酰呋喃、5-甲基糠醛、5-羟甲基糠醛4种糠醛类物质，其中5-羟甲基糠醛的含量相对较高，最高的检出值达到了6.44 mg/kg，可能存在一定的安全风险，应引起人们的关注。