介入瓣膜瓣中瓣模式下耐久性能测试及评价

刘 丽，万辰杰，王 硕，李崇崇，柯林楠

随着生物瓣膜材料和技术的不断进展，以及对机械瓣膜终身抗凝并发症的重视，越来越多的临床研究显示了生物瓣的优越性[1~4]。欧洲心脏病学会（European Society of Cardiology，ESC）/欧洲心胸外科学会（European Association for Cardio-Thoracic Surgery，EACTS）2017年发布的瓣膜性心脏病治疗指南（ESC/EACTSguidelines for the management of valvular heart disease）[5]推荐50岁以下患者选择机械瓣，70岁以上患者选择生物瓣，50～70岁患者两种瓣膜都可以考虑，临床生物外科瓣膜植入患者年龄有降低的趋势。生物瓣膜一般使用牛心包或者猪主动脉瓣制作，优势在于患者不需要终生服用抗凝药物，但生物瓣膜发生瓣膜毁损和再次手术的风险更高，再次开胸手术的风险比首次手术明显增高。随着介入瓣的发展，2008年介入瓣膜瓣中瓣技术开始在临床上逐渐尝试使用[6~10]。介入瓣膜瓣中瓣通常不需要开胸和体外循环，瓣膜压缩至输送系统，经导管植入至毁损生物瓣膜位置，患者创伤小，恢复快，尤其适用于不能再次承受开胸手术的高危患者。近2年来，中国国内也开始开展瓣中瓣临床研究[11，12]。但是介入瓣膜直接安装在已毁损的外科生物瓣膜内，导致植入的介入瓣面积更小，瓣膜跨瓣压差增加，从而可能影响瓣膜寿命。目前介入瓣膜瓣中瓣临床使用时间尚短，缺少长期临床研究数据[13~18]。笔者采用体外加速方法，对一种介入瓣膜瓣中瓣模式下耐久性能进行研究，可作为介入瓣膜瓣中瓣临床前体外评价的参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验样品

将介入瓣膜（规格23 mm、27 mm、29 mm）按照说明书通过输送系统安装在对应规格外科生物瓣膜中作为实验样品形成瓣中瓣。由于放入介入瓣之前利用外科瓣的支架弹性及特殊设计对其进行了预扩张，使得放入介入瓣膜后瓣口内径仍可维持原尺寸。所有测试环境参数模拟及标准参照为主动脉瓣位。

1.1.2 实验试剂与仪器

流体：0.9%氯化钠溶液（生理盐水）。

人工心脏瓣膜疲劳测试系统（提供100 mmHg的平均反向压力，1 000次/分的加速频率）、模块化人工心脏瓣膜脉动流测试系统（模拟主动脉瓣部位流动环境，提供生理压力及流量波形，2～7 L/min的模拟心输出量）（上海心瓣测试设备有限公司，中国）。差示扫描量热仪（DSC 214 Polyma。Netzsch，德国）；双光子共聚焦显微镜（A1R MP。Nikon，日本）。

1.2 方法

1.2.1 样品预处理

在实验台的瓣膜安装位置先安装外科生物瓣膜（牛心包），进行测试后利用其瓣架上的特殊装置及材料本身的弹性用球囊将其内径扩大，使得介入瓣膜放入后与原先测试的外科瓣膜有相同的瓣口内径。将介入瓣膜按照使用说明压握至适用规格的输送系统上，按实验管路通过输送系统放入对应规格的外科瓣膜中（实验瓣膜的规格为23/27/29 mm 3个尺寸），形成瓣中瓣模式。

1.2.2 耐久性能实验

耐久性能测试是评价瓣膜长期有效性的体外测试方法。该实验模拟瓣膜临床使用条件及使用时间，对瓣膜的长期使用性能进行评估。根据YY/T 1449.3—2016及ISO 5840-3：2013介入瓣膜标准，对于介入瓣膜一般考虑模拟临床使用5年（2.0亿次循环）过程中瓣膜的性能进行评价。利用人工心脏瓣膜疲劳测试系统对组装好的介入瓣膜瓣中瓣进行耐久性能测试[19，20]。调节电机运动幅值及频率，使得通过测试瓣膜平均跨瓣压差为13.3 kPa（100 mmHg），至少95%循环达到通过闭合瓣膜的定义目标压差峰值13.3 kPa（100 mmHg），每个循环中至少有5%的时间里所受压差是等于或大于13.3 kPa（100 mmHg）。

1.2.3 脉动流参数测量

采用模块化人工心脏瓣膜脉动流测试系统进行脉动流实验[19，20]。测试瓣膜每0.5亿次进行脉动流性能测试。在平均主动脉压13.3 kPa（100 mmHg）、频率为70次/分、模拟心输出量为5.0 L/min的实验条件下，测试瓣膜的平均跨瓣压差、反流百分比、有效瓣口面积、泄漏量和关闭量。将0次、0.5亿次、1.0亿次、1.5亿次、2.0亿次的介入瓣膜瓣中瓣脉动流性能测试数据进行对比、分析。

1.2.4 瓣叶热力学分析

分别取疲劳测试前后的介入瓣膜的瓣叶，用滤纸吸干表面水分，称量约5 mg，置于差示扫描量热仪的铝制样品盘中，密封加热，起始温度10℃，每分钟升高2℃，最终温度150℃。以吸热峰值作为样品的变性温度。

1.2.5 瓣叶胶原纤维结构分析

分别取疲劳测试前后的介入瓣膜的瓣叶，在双光子共聚焦显微镜下观察，激光设置为840 nm的激发波长，以诱导细胞外基质依赖的自体荧光和二次谐波（second harmonic generation，SHG）产生。选择检测器前的低通滤波器采集胶原的SHG信号。探测器的针孔被设置为最大值以收集焦平面上产生的所有光。观察胶原纤维的结构。

1.3 统计学方法

运用SPSS统计软件线性回归方法对耐久性能测试中介入瓣膜瓣中瓣脉动流性能的稳定性进行分析，采用配对t检验对瓣叶热变性温度进行分析。

2 结果

2.1 3种介入瓣膜脉动流参数测量结果

2.1.1 3种介入瓣膜脉动流参数比较

每0.5亿次后进行脉动流性能测试。23 mm瓣中瓣平均跨瓣压差为1.92～1.98 kPa（14.4～14.9 mmHg），反流百分比为7.2%～3.3%，有效瓣口面积为1.45～1.66 cm2；27 mm瓣中瓣平均跨瓣压差为0.92～1.64 kPa（6.9～12.3 mmHg），反流百分比为14.9%～3.3%，有效瓣口面积为1.88～2.17 cm2；29 mm瓣中瓣平均跨瓣压差为0.72～1.02 kPa（5.4～7.4 mmHg），反流百分比为14.7%～3.9%，有效瓣口面积为2.24～2.54 cm2。见图1～3。采用线性回归方法对脉动流测试数据进行分析，在95%可信区间，平均跨瓣压差、反流百分比和有效瓣口面积无显著性变化趋势。

图1 3种介入瓣膜瓣中瓣平均跨瓣压差比较柱状图Fig.1 Comparison histogram of mean valve difference pressure in 3 of valve in valve-transcatheter heart valves

图2 3种介入瓣膜瓣中瓣反流百分比比较柱状图Fig.2 Comparison histogram of reflux percentage in 3 of valve in valve-transcatheter heart valves

图3 3种介入瓣膜瓣中瓣有效瓣口面积比较柱状图Fig.3 Comparison histogram of effective valve area in 3 of valve in valve-transcatheter heart valves

2.1.2 3种介入瓣膜瓣中瓣反流量比较

介入瓣膜瓣中瓣反流量分为2部分，即泄漏量和关闭量。2.0亿次疲劳测试过程中，23 mm瓣中瓣关闭量为1.40～0.82 mL，泄漏量为3.83～1.52 mL；27 mm瓣中瓣关闭量为4.03～1.29 mL，泄漏量为6.53～0.44 mL；29 mm瓣中瓣关闭量为3.63~2.12 mL，泄漏量为7.02～0.66 mL。见图4。采用线性回归方法对脉动流测试数据进行分析，在95%可信区间，29 mm瓣中瓣泄漏量明显减小，差异有显著性，其余泄漏量和关闭量均无显著性变化趋势。

图4 3种介入瓣膜瓣中瓣反流量比较Fig.4 Comparison histogram of reflex in 3 of valve in valvetranscatheter heart valves

2.1.3 在标准条件下，脉动流性能参数比较

介入瓣膜瓣中瓣在13.3 kPa（100 mmHg）平均压力、70次/分心率、5 L/min心输出量下的脉动流性能数据符合YY/T 1449.3—2016规定值。YY/T1449.3—2016《心血管植入物 人工心脏瓣膜 第3部分：经导管植入式人工心脏瓣膜》（等同转化于ISO 5840-3：2013）对于左心植入的介入瓣膜的最低脉动流性能做了规定（表1）。从表1可以看出，经过2.0亿次疲劳测试的介入瓣膜瓣中瓣在13.3 kPa（100 mmHg）平均压力、70次/分心率、5 L/min心输出量下的脉动流性能实验结果完全满足该标准的要求，说明介入瓣膜瓣中瓣经过2.0亿次疲劳测试后仍具有良好的脉动流性能。

表1 3种介入瓣膜瓣中瓣脉动流性能实验结果Tab.1 Comparison pulsatile-flow testing performance in 3 of valve in valve-transcatheter heart valves

2.2 3种介入瓣膜热力学分析测试结果

介入瓣膜瓣中瓣疲劳测试前后，瓣叶热变性温度下降（图5），疲劳测试前瓣叶热变性温度为（105.40±0.92）℃，疲劳测试后瓣叶热变性温度为（98.10±0.50）℃（n=3），差异有统计学意义（t=9.031，P<0.05）。

图5 3种介入瓣膜瓣叶热力学分析测试曲线Fig.5 Thermodynamic analysis test curve in 3 leaflet in valve-transcatheter heart

2.3 瓣膜耐久性测试病理变化

耐久性能测试前后的介入瓣膜瓣中瓣瓣叶在双光子共聚焦显微镜下观察，激光激发波长为840 nm，测试结果见图6。从图6可以看出，经过2.0亿次疲劳测试后，瓣叶材料在双光子共聚焦显微镜下观察到，胶原纤维形状发生变化，由疲劳测试前卷曲的立体结构，变为疲劳测试后波浪形线状结构，可能是部分化学键丢失，跟热变性温度的表现是一致的。

图6 双光子共聚焦显微镜下840 nm激发波长下的介入瓣膜瓣叶疲劳实验前后图像Fig.6 Images of before and after leaflet in valve-transcatheter heart fatigue experiment at 840 nm excitation wavelength under two-photon confocal microscope

3 讨论

随着外科生物瓣膜植入时间的推移，越来越多的植入的生物瓣膜发生毁损或钙化，介入瓣膜作为瓣中瓣的应用逐渐增多，但由于介入瓣膜瓣中瓣植入时间还很短，目前没有长期临床数据可以参考。笔者首次通过体外加速疲劳测试，模拟介入瓣膜瓣中瓣植入5年的使用时间（2.0亿次瓣膜开闭），并对疲劳测试后瓣膜流体力学性能、瓣膜瓣叶的热变性温度、胶原蛋白纤维结构进行了评价。

经过2.0亿次耐疲劳测试，介入瓣膜瓣中瓣平均跨瓣压差无显著变化，反流百分比减小，有效瓣口面积基本一致。其中瓣膜反流量包括2部分，瓣膜关闭过程中产生的关闭量和瓣膜关闭后发生的泄漏量。2.0亿次疲劳实验过程中，瓣膜关闭量无明显变化，但泄漏量在逐渐减小。说明瓣膜疲劳测试过程中，泄漏量减小是反流百分比减小的原因。瓣膜泄漏量减小说明3个瓣叶运动中配合度越来越好。

YY/T 1449.3—2016《心血管植入物 人工心脏瓣膜 第3部分：经导管植入式人工心脏瓣膜》（等同转化于ISO 5840-3：2013）对于左心植入的介入瓣膜的最低脉动流性能做了规定，经过2.0亿次疲劳测试的介入瓣膜瓣中瓣在13.3 kPa（100 mmHg）平均压力、70次/分心率、5 L/min心输出量下的脉动流性能实验结果完全满足该标准的要求，说明介入瓣膜瓣中瓣经过2.0亿次疲劳测试后仍具有良好的脉动流性能。

经过2.0亿次疲劳测试后，瓣叶材料的热力学变性温度降低，热变性温度是组织内存在化学键的表现，这些键维持了蛋白质内或蛋白质间三维、四维结构的稳定。疲劳测试后热变性温度降低，可能是一些化学键受到破坏，键合程度降低，瓣叶交联程度降低。瓣叶材料在双光子共聚焦显微镜下观察到，胶原纤维形状发生变化，由疲劳测试前卷曲的立体结构，变为疲劳测试后波浪形线状结构，表明部分化学键丢失，跟热变性温度的表现是一致的。

笔者对一种介入瓣膜瓣中瓣进行耐久性能测试，并首次采用热力学分析和双光子共聚焦显微镜对耐久性能测试后的瓣叶进行分析，从微观角度对介入瓣膜瓣中瓣耐久性能进行评价。经过2.0亿次耐久性能测试，介入瓣膜瓣中瓣流体力学性能无显著变化，但瓣叶在纤维结构方面发生了变化，说明热变性温度和胶原纤维结构对于评价生物瓣膜耐久性能具有一定意义。

4 结论

介入瓣膜瓣中瓣经过2.0亿次疲劳测试后，瓣叶胶原纤维结构由完整的三维结构变为线性二维结构，热变性温度降低，但瓣膜脉动流性能指标未发生变化，且均满足YY/T 1449.3—2016标准中介入瓣膜的脉动流性能要求。说明疲劳测试后，介入瓣膜瓣中瓣微观结构发生了变化，但仍具有良好的流体力学性能。

5 不足和展望

笔者研究中将介入瓣膜放入完好的外科生物瓣膜中进行测试，未模拟出外科瓣膜毁损甚至钙化的情况，而这类情况的发生是患者需要放入瓣中瓣的主要原因。当外科瓣膜发生毁损（钙化），可能导致植入的瓣中瓣局部变形，从而影响瓣中瓣的耐久性能。由于毁损和钙化情况多种多样，很难选择测试标准模型。由于该模型的重要性，目前在收集临床病例的影像数据，试图建立具有代表性的瓣中瓣测试周围锚定几何模型。