产蛋白微藻Desmondesmus sp.ZM-3降解养猪废水及其资源化研究

赵昕悦，刘 妍，孟祥伟，党 斌，薛 莹，李 航，李 备，侯 宁，李春艳*

（1.东北农业大学资源与环境学院，哈尔滨 150030；2.长春长光辰英生物科学仪器有限公司，长春 130033）

近年来，我国畜禽养殖废水大量排放给环境治理带来巨大压力。以养猪废水为例，未经处理的废水中氮、磷含量较高，如果不加以处理，排入水体后导致水体富营养化，对人体造成巨大危害。当前的传统畜禽养殖废水处理方法主要包括物化法和微生物法两种[1]。物化方法对畜禽养殖废水中氨氮、总磷、COD、重金属有一定去除能力，但处理成本高，缺少实际应用经验，目前仍处于测试阶段[2]。微生物法虽对畜禽养殖废水中COD 去除效率较高，但对氮、磷去除效果并不理想，且运行过程复杂，设备构建成本高，占地面积大，资源化产物产率低[1]。例如，李东伟等采用投药气浮-UASB-SBR 组合工艺处理马铃薯淀粉废水，出水水质达标排放，但运行过程中仅提取约4.0 kg·t-1蛋白饲料,资源化利用效率明显偏低[3]。

近年来微藻处理模式日益受关注。微藻种类多，广泛存在于自然界各类水环境中，具有环境适应能力强、生长周期短、养殖成本低、光和效率高、对氮磷耐受力强等优点[4]。微藻在合适温度和光照等条件下利用养猪废水，收获较高生物质产量。微藻还可高效去除废水中COD、氮、磷等污染物，同时产生大量蛋白质、多糖、油脂等生物质能源，这些资源化产物可作为饲料、肥料、生物质燃料等[5]。因此，将废水处理与微藻培养相结合，将是畜禽养殖废水处理领域未来发展方向。

利用废水培养微藻并生产蛋白质、多糖、油脂、色素、维生素等有价值化合物，并应用于生产化妆品、食品、饲料、药物等是目前微藻研究中一个十分重要且极具前景的领域。本文研究的众多资源化产物已在各个领域发挥不同作用，其中酶制剂生产和利用是蛋白质资源化利用的新兴方向；微藻蛋白中存在许多活性肽和多糖成分，由于高价值多肽和复合多糖在抗氧化和抗肿瘤方面存在较大效用，例如，黄永梅等从海洋微藻中分离出多肽和多糖，这些活性物质对结肠直肠癌症起到一定预防作用[6]；此外，利用微藻生产生物柴油也是一种高效的生物质能获取方法，通常利用超临界二氧化碳萃取技术、超临界甲醇脂交换法或高温高压液化技术将微藻产生的油脂转化成生物柴油，并应用于工业生产中[7-8]。

本研究利用单细胞分选仪PRECI SCS（型号HOOKE P30）直接分选目标单细胞微藻ZM-3，单细胞扩大培养后进行鉴定。研究筛选微藻ZM-3理化性质，探索ZM-3 产油脂、蛋白质及多糖能力。通过单因素试验，从温度、pH、废水浓度、光照时间、光照强度、碳氮比等方面，研究养猪废水中COD、总氮、总磷含量，研究不同条件变化对微藻降解养猪废水能力的影响。本研究可为基于微藻培养的蓄禽养殖废水处理技术提供理想藻种和理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

试验试剂：酒石酸锑氧钾、氢氧化钠、氯化氢、硫酸、抗坏血酸、过硫酸钾、重铬酸钾、钼酸铵等，其中化学试剂纯度均为分析纯，试验用水为去离子水。

试验仪器：单细胞分选仪器（型号HOOKE P30）、生化培养箱（型号BSP-100）、可见分光光度计（型号UV-1800PC）、磁力搅拌器（型号MSB-1C）、COD 消解仪（型号58-3C）、高温灭菌锅（型号LDZX-30KBS）、离心机（5417R）和水浴锅（DK-24）等。

样品采集：试验所需微藻源为哈尔滨周边哈尔滨市三宝种猪场附近人工湿地水体。

微藻培养基：采用BG-11 培养基，培养基组分为1.5 g·L-1NaNO3；0.075 g·L-1MgSO4·7H2O；0.036 g·L-1CaCl2·2H2O；0.006 g·L-1C6H8O7；0.006 g·L-1C6H8FeNO7；0.000049 g·L-1Co(NO3)2·6H2O；0.000079 g·L-1CuSO4·5H2O；0.001 g·L-1EDTA；0.00286 g·L-1H3BO3；0.04 g·L-1K2HPO4·3H2O；0.02 g·L-1Na2CO3；0.00039 g·L-1Na2MoO4·2H2O；0.00181 g·L-1MnCl2·H2O；0.000222 g·L-1ZnSO4·7H2O。

养猪废水：试验所用养猪废水配方及成分见表1。

表1 不同初始COD浓度养猪废水指标Table 1 Piggery wastewater index with different initial COD concentrations （g）

1.2 方法

1.2.1 单细胞分选

本研究利用激光诱导向前转移（Laser-induced forward transfer，LIFT）单细胞分选技术，将收集水样充分混合均匀，取0.5 μL 样品于分选芯片上，通过单细胞分选仪收集细胞显微成像。其后，在显微成像中定位目标微藻单细胞并分离和接收单细胞。将接收器接收的微藻单细胞转移至含有3.0 g·L-1葡萄糖BG-11 液体培养基的细胞培养管中，置于振荡培养箱中30 ℃，400 r·min-1转速，24 h 光照培养。若单细胞成功增殖，则将此藻液继续转移至含有3.0 g·L-1葡萄糖BG-11 液体培养基中扩大培养。从扩大培养后藻液中转移15 μL藻液于BG-11 固体培养基中开展三区划线，直至出现单藻落。

1.2.2 目标微藻18S rRNA鉴定

在含有BG-11 固体培养基平板上取三代纯化后单藻落，使用Easy Pure TM Plant Genomic DNA Kit（购自北京全式金生物技术有限公司）提取微藻总DNA，采用通用引物18SF（5'CCTGGTTGATCCTG CCAG 3'）和18SR（5'TTGATCCTTCTGCAGGTTCA 3'）作PCR 扩增后，送至北京六合华大基因科技有限公司作18S rRNA 测序。测序序列在NCBI 数据库中作Blast比对分析，采用MEGA7构建系统发育树。

1.2.3 微藻生物量测定

本研究采用光密度（OD）法测定微藻生物量，将藻液室温培养42 h，每隔2 h在波长680 nm处测量藻液OD值，记录并绘制其生长曲线[9]。

1.2.4 微藻理化性质检测

本研究选用考马斯亮蓝法、蒽酮比色法和有机溶剂萃取法分别检测分析微藻中蛋白质、多糖和油脂含量[10-12]。

1.2.5 单因素试验

选用单因素设计研究温度、pH、养猪废水浓度、光照时间、光照强度和碳氮比对微藻去除养猪废水能力的影响。首先，配置养猪废水，调节溶液pH，放入转子后高压蒸汽灭菌废水。取10 mL藻液，离心处理后弃上清，将藻细胞转入养猪废水中培养，待开展试验时，分别于12、24、36、48、60 h 取样，每次取样20 mL，离心取上清，分析微藻去除养猪废水中COD、TN、TP 能力。其中，按照表2所示控制条件作单因素试验，依次改变温度、pH、废水浓度、光照强度、光照时间、碳氮比6个条件，当改变试验中某一因素时，固定其他因素条件不变，探究这6个环境因素对微藻降解废水中污染物的能力。

表2 单因素试验控制条件Table 2 Single factor experiments

2 结果与分析

2.1 单细胞分选

如图1a和b中分选过程所示，采用PRECI SCS单细胞分选仪识别目标藻细胞，分选前在载物台上对微藻单细胞完成精准定位，分选中利用LIFT技术对目标单细胞微藻进行弹射分选，仪器接收系统自动收集目标单细胞，分选后原目标藻细胞位置消失，其他细胞无变化。本研究方法是一种非侵入式方法，对目标细胞几乎无影响，被采集器收集的单细胞可用于后续研究。

2.2 微藻ZM-3鉴定

提取微藻ZM-3 基因组DNA，PCR 扩增其18S rRNA序列并测序，通过NCBI将测序所得序列进行Blast比对，并用MEGA 7软件构建系统发育树，见图1c。结果显示，ZM-3 与Desmodesmussp. GM4a（AB917128.1）、Desmodesmussp.GB1a（AB917097.1）、Desmodesmusabundans strain CCAP（MW471025.1）相似，相似度为99.94%。因此，经分子生物学鉴定该微藻属于栅藻属，并将其命名为Desmondesmussp.ZM-3，GenBank登录号为MZ570911。

2.3 微藻ZM-3生长

如图1d 中所示，在42 h 内培养并测定微藻ZM-3 光密度，发现其OD680在0.035～0.237 之间变化。在2～28 h内OD680呈持续增加趋势，由0.035指数增长至0.237，因为微藻ZM-3 在短暂调整期过后立即进入对数生长期；而28～32 h微藻生长保持稳定状态，OD680保持不变；在32 h 后OD680呈急速下降趋势，微藻进入衰亡期。

图1 ZM-3分选、培养及鉴定Fig.1 Sorting,culture,and identification of ZM-3

2.4 理化性质

微藻收集方式包括离心法、沉淀法、絮凝法等，本研究采用获取微藻效率最高的离心法回收藻种。理化性质试验结果表明，栅藻ZM-3在处理养猪废水同时，每克细胞还产生蛋白质201.9 mg、多糖139.1 mg 和油脂41.5 mg。与其他研究[13-14]相比，本研究选用微藻产蛋白能力较强，产多糖能力次之，并产生少量油脂。

在藻细胞中，蛋白质是细胞膜结构主要成分，且在生产代谢中发挥十分重要作用，例如藻蛋白可作为光合作用催化酶。本研究分选得到ZM-3是一株产蛋白微藻，可在废水处理同时产生201.9 mg·g-1蛋白质。

此外，碳水化合物可附着在蛋白质或脂类上形成复合多糖，成为微藻细胞资源化重要产物。本研究发现，栅藻ZM-3 可产生139.1 mg·g-1多糖，包括单糖、寡糖和多糖等，可应用于医药、食品、个人护理品、饲料等行业。本研究选用有机溶剂萃取法从栅藻ZM-3 中提取41.5 mg·g-1油脂，后续可继续转化为生物燃料，如生物柴油、生物质油、乙醇、脂肪酸、氢气等。

2.5 不同条件栅藻ZM-3对养猪废水降解能力研究

2.5.1 不同温度

温度是影响栅藻生长代谢最重要因素之一，栅藻生长最适温度一般为22～30 ℃[15]。由图2 可知，不同温度下栅藻ZM-3 对养猪废水中COD、TN、TP 降解能力相似，升高温度可提高栅藻ZM-3 降解污染物能力，但过高温度也导致微藻对COD、TN、TP 降解率降低，因此存在一个最适温度区间。在20～30 ℃时，ZM-3 对养猪废水中COD、TN、TP 去除率均呈现较高水平，在这一温度范围内栅藻生长代谢速度快、生物量高，因此降解效率高，超过30 ℃后去除率均有所下降。在24 h，温度30 ℃时，ZM-3 对COD、TN、TP 降解率最高，分别达到62.57%、44.26%、55.82%，因此，在实际应用中控制温度条件在25～35 ℃，更有利于栅藻ZM-3去除废水中COD、TN、TP。

图2 不同温度对栅藻ZM-3降解养猪废水能力的影响Fig.2 Effects of different temperatures on the ability of ZM-3 to degrade pig wastewater

2.5.2 不同pH

pH 作为一种常见环境因子，也对栅藻生长代谢产生较大影响，栅藻生长最适pH在6～8。李飞等提出微藻生长中无机碳以重碳酸盐和碳酸盐形式存在，生长过程中微藻吸收二氧化碳释放氢氧根，使环境呈弱碱性；较高pH影响微藻生长，促进氨氮解吸去除和总磷沉淀化[16]。由图3可知，本研究pH由5升至7时，COD、TN、TP降解率随之升高，而继续升高pH导致降解率有所下降，这可能是因偏碱性环境影响栅藻某种胞外酶活性从而危害其生长代谢所致。综上所述，栅藻ZM-3 降解COD、TN、TP最适条件为在pH 7时，最高降解率分别可达64.75%、45.61%、57.61%。在后续应用中若控制pH在6～8则更利于栅藻ZM-3净化养猪废水。

图3 不同pH对栅藻ZM-3降解养猪废水能力的影响Fig.3 Effects of different pH on the ability of ZM-3 to degrade pig wastewater

2.5.3 不同废水浓度

由于不同养猪废水浓度影响营养元素如碳、氮、磷、钾、钠、镁含量，栅藻生长代谢直接受到这些营养物质浓度的影响，进而影响其对废水中COD、TN、TP 的降解能力。由图4 可知，12 h时，取样测得栅藻ZM-3对废水降解率随废水浓度变化不明显，结合图4生长曲线变化规律，这可能是时间较短导致栅藻在废水中未稳定生长。12 h后，随废水浓度增加，ZM-3 对养猪废水中COD、TN、TP 降解率也逐渐提高。Michalis-Menten 酶动力模型提出随废水浓度升高微藻吸收污染物能力增强，当浓度达到一定值时，微藻吸收速率趋于稳定。本研究中随废水浓度升高，栅藻ZM-3 也符合以上规律，其中栅藻降解污染物最佳废水浓度为600 mg·L-1，在实际大规模废水处理中可适当调节水体浓度，实现栅藻ZM-3高效应用。

图4 不同废水浓度对栅藻ZM-3降解养猪废水能力的影响Fig.4 Effects of different wastewater concentrations on the ability of ZM-3 to degrade pig wastewater

2.5.4 不同光照强度和光照时间

微藻作为一种光自养型生物，光强和光照时间直接影响栅藻光合速率，进而影响微藻生长及降解废水。如图5 所示，栅藻ZM-3 对养猪废水中COD、TN、TP 降解能力与光照强度和光照时间均呈正比，可能因栅藻ZM-3光合作用直接受光照影响，光合作用过程中完成COD、TN、TP 的吸收。而在48和60 h时，随光强及光照时间增加，ZM-3对废水降解率呈下降趋势，一方面可能是光强上升到一定程度造成的光损伤有损微藻细胞结构，降低微藻生物量积累，进而导致微藻对废水降解能力变低[17]；另一方面可能是微藻密度过高遮挡光透射，产生光抑制现象，导致藻生物量降低，影响微藻对废水中污染物的降解[18]。综合试验数据可知，栅藻ZM-3 在光照强度6 000 lx 和光照时间24 h 时，对COD、TN、TP 最高降解率分别可达62.57%，44.26%和55.82%，在实际应用中可控制光照强度在6 000 lx 和光照时间在24 h。

图5 不同光照强度和光照时间对栅藻ZM-3降解养猪废水能力的影响Fig.5 Effects of different light intensity and light time on the capacity of ZM-3 to degrade pig wastewater

2.5.5 不同碳氮比

不同碳氮比对栅藻ZM-3降解养猪废水能力的影响如图6 所示，废水中不同碳氮比对微藻降解COD、TN 和TP 差异明显。其中，当碳氮比为4∶3时，微藻ZM-3 对COD 去除效果最佳，降解率为62.57%；当碳氮比为8∶1时，微藻ZM-3对TN去除效果最佳，降解率为46.72%；当碳氮比为16∶1时，微藻ZM-3 对TP 去除效果最佳，降解率为68.34%。范同强等研究发现，氮源不足导致藻细胞内胡萝卜素及叶绿素含量有所降低[19]，因此可推断氮含量低会降低栅藻ZM-3光合速率，其生长代谢能力随之减弱。在生产应用中，应根据实际污水处理需求适当控制废水中碳氮比，实现污水中污染物高效转化。

图6 不同碳氮比对栅藻ZM-3降解养猪废水能力的影响Fig.6 Effects of different C/N ratio on the ability of ZM-3 to degrade pig wastewater

3 讨 论

3.1 Desmondesmus sp.ZM-3单细胞分选

传统平板划线分离方法分离周期长、分离操作密集且不适用于99%以上未培养微生物的分选操作。因此，迫切需要一种高效的微生物分选方法。目前，部分研究采用荧光活化细胞分选法（Fluorescence-activated cell sorting,FACS）筛选和分离微藻单细胞。然而，FACS 在分选过程中可能破坏脆弱或受压力的细胞结构，增加单细胞分选后扩大培养难度。利用LIFT 系统可精确定位目标单细胞，直接从复杂样本中分离目标单细胞。该系统分选单细胞无需外部标记分子，可将对目标分离细胞的负面影响降到最低，使分选后微藻单细胞有扩大培养的可能。本研究结果表明，Desmondesmussp.ZM-3 经LIFT 系统分选后开展大规模培养。因此，LIFT 系统可作为一种结合单细胞分选技术作微藻分选的新方法。

3.2 Desmondesmus sp. ZM-3 废水降解及资源化研究

随环境友好型需求日益增长，养猪废水合理处理和资源化研究逐步成为焦点。生物技术作为相对廉价的处理技术，如膜生物反应器、人工湿地和高速率藻池近年来成为研究热点。但人工湿地等处理技术仅局限于废水处理效果。然而，基于微藻的生物处理技术不仅具有废水生物修复能力，且可积累生物质组分（蛋白质等）。本研究中，Desmondesmussp. ZM-3 对养猪废水中碳、氮和磷有较高处理效果，且同时在藻细胞中积累具有资源化价值的生物质（油脂41.5 mg·L-1、蛋白201.9 mg·L-1和多糖139.1 mg·L-1）。李亚丽等研究也表明，微藻可有效去除养猪废水中碳、氮、磷等物质，并在能源、食品、药物等方面具有资源化价值[20]。与其他研究相比，本研究选用的微藻产蛋白能力较强，产多糖能力次之，并产生少量油脂。结果表明，Desmondesmussp. ZM-3 在食品和医药方面应用价值较高。

3.2.1 Desmondesmus sp.ZM-3产蛋白

近年关于产蛋白微藻研究中，王浩华测定红藻G.sulphuraria074G 蛋白产率发现，在相同培养条件下，其蛋白产量可达到17.25 mg·L-1，而本文所筛选得到栅藻ZM-3 蛋白产量相比074G 仍高出2.94%[21]。D'Este 等以海带为基质培养异养微藻C.protothecoides，其蛋白质产量为（0.07±0.06）g·L-1，相对本研究栅藻ZM-3 蛋白产量低13.1%[22]。微藻蛋白中含有多种活性肽成分，大多是具有高利用价值的功能活性多肽。此外，微藻蛋白中还含有卵清蛋白、乳球蛋白等优质蛋白质，是哺乳动物无法合成的必需氨基酸，因此被联合国粮农组织（FAO）列为21 世纪绿色食品。李孟研等从微藻裂殖壶菌中酶解得到的肽混合物（MESH）可用于治疗水产鱼类肠道炎症[23]。因此推测，栅藻ZM-3 中多肽也可能具有抗氧化、抗癌症功能，且其微藻蛋白在生物制药、抗氧化功能食品加工和化妆品等领域也将具有一定应用价值和发展前景。

3.2.2 Desmondesmus sp.ZM-3产多糖

微藻多糖作为微藻通过光合及代谢合成的一种有机质，大多具有生物活性。且微藻中多糖种类多样，研究发现其主要具有抗病毒、抗肿瘤、抗衰老、抗炎免疫、降血糖、调血脂等多种生物活性作用[24]。某些多糖还具有抗炎症和润肤作用，可广泛应用于化妆品中。周妍等研究5 种海洋微藻多糖对小鼠体外免疫细胞功能的影响，从中筛选出免疫调节活性较强的紫球藻多糖，其具有增强吞噬细胞的吞噬功能，进而增强小鼠体外免疫活性功能[25]。因此推测，ZM-3 产多糖可能具备抗氧化、增强免疫等功能，其应用价值有待发现及推广。

3.2.3 Desmondesmus sp.ZM-3产油脂

由微藻产油脂转化而来的生物燃料可通过热裂解生物质等技术得到长链脂肪酸的单烷基酯，是一种非常重要的可再生资源，且效能高、污染少。油脂还以脂肪酸形式形成生物柴油，与动植物生产生物柴油相比，微藻产油效率高，不占用耕地，在国内外研究较多[26-27]。缪晓玲等利用异样转化细胞工程技术获取小球藻细胞，热解小球藻获得生物质燃油热值高达33 MJ·kg-1，油脂含量高达55%，其后再通过蒸馏干燥萃取等方式获得生物柴油[28]。栅藻ZM-3 中也存在此微藻油脂，可通过同样手段提取生物柴油用于生产生活。近年来，世界多家化工石油公司已致力于微藻生产生物柴油领域，虽然目前存在产油率低和成本高等问题，但随着技术不断进步，微藻产油在未来必然会进入工业化生产阶段。

3.3 Desmondesmus sp.ZM-3单因素研究

任何军等研究证实环境因素之间的影响并不独立，存在相互作用[29]。然而，本研究通过控制单一环境因素变化，研究其对Desmondesmussp.ZM-3降解效果的影响，结果具有一定局限性。通过模型综合研究多环境因素的相互影响是进一步研究方向。此外，如何平衡废水降解和资源回收可能是一个有待解决的问题。Guštin等发现提高废水处理效果同时，资源化效果明显降低[30]。同时，也有研究为提高资源化效果，废水处理效果不甚理想。因此，如何同时提高生物质积累和废水处理是未来研究方向。

4 结论

本研究对ZM-3开展单细胞分选、18S rRNA鉴定、理化性质检测和单因素试验，并探讨其资源化利用产物应用以及环境因子对污水降解能力的影响，得到以下结论：

a.通过无需标记、快速简便的单细胞分选方式得到目标藻细胞，扩大培养后经18S rRNA 鉴定可知该微藻属于栅藻属，并将其命名为Desmondes⁃mussp.ZM-3。

b. 对Desmondesmussp. ZM-3 细胞产生的蛋白质、多糖、油脂作定量分析，结果显示ZM-3对废水资源化利用产生的蛋白质含量较高，达到201.9 mg·g-1，含有多糖139.1 mg·g-1，油脂41.5 mg·g-1。作为一株产蛋白栅藻，ZM-3在食品生产和生物制药等方面经济价值较高。

c.Desmondesmussp. ZM-3 在30 ℃，pH 7，废水浓度为600 mg·L-1，光照强度6 000 lx，光照时间24 h条件下，对养猪废水中COD、TN、TP 降解率最高。若后续应用栅藻ZM-3开展大规模废水处理过程中，控制条件因素指标可增强ZM-3对污染物降解能力，提高污水净化效率。