干旱胁迫后复水对新疆大叶苜蓿幼苗光合和叶绿素荧光的影响
2022-06-02南思睿罗永忠于思敏仝慧鑫
南思睿，罗永忠，于思敏，何 钰，仝慧鑫
(甘肃农业大学林学院，甘肃 兰州 730070)
随着全球气候的变暖，极端干旱天气日益频发[1]，导致植物干旱缺水的情况愈加严重。在干旱、半干旱地区，由于降雨少且分配不均，植物遭受的干旱胁迫往往存在一定的阶段性。受该地区降雨格局的影响，植物生长环境经常出现干旱与降水交替的现象[2]。当植物受到干旱胁迫时，植物能否正常生长不仅取决于植物自身抗旱性的强弱，还受到干旱及复水后其恢复生长能力的影响[3]。因此，通过研究干旱胁迫及复水对植物生长的影响，对了解植物如何应对逆境胁迫环境具有重要意义。
光合作用为植物提供物质和能量，是植物最重要的生命活动之一[4]，也是植物耐旱性的评价指标之一。当土壤水分不足时，则对植物的生长发育产生抑制，显著影响光合作用的进行[5]，同时破坏光合膜的结构，阻止各种色素的合成，导致光合作用下降[6]。研究发现，在逆境条件下，初始荧光Fo增加量越多，表明植物受损伤程度越严重[7]。而植物叶绿素荧光参数在受到逆境胁迫时也会发生变化，其参数变化能够有效反映“内在性”特点[8]。干旱及复水是农业生产上常见的现象之一。当植物经过一段时间的干旱，及时的降雨能够一定程度地修复植物的生理生化功能，补偿因干旱胁迫而产生的损失[9]，不同植物或同一植物不同品种之间恢复能力的大小也不相同[10]。王磊等[11]通过对大豆(Glycinemax)干旱及复水的研究发现，在复水后，豫豆29(Glycinemaxcv. yudou29)的光合参数和荧光参数等值均能够很快得到恢复，甚至接近对照组的水平，表明豫豆29在干旱胁迫解除后具有较强的恢复能力。因此，研究干旱及复水对植物幼苗光合和叶绿素荧光的影响，能为全面了解植物的干旱适应能力提供重要的理论依据。
紫花苜蓿(Medicagosativa)是干旱、半干旱地区普遍种植且产业化发展情景良好的优良牧草[12]。因其营养价值高和产量好等优点被誉为“牧草之王”[13]。新疆大叶苜蓿(M.sativacv. xinjiangdaye)是西北地区大面积种植的紫花苜蓿品种，具有较强的抗旱性。目前，关于新疆大叶苜蓿的研究主要集中在种子萌发[14]、形态特征[15-16]、生理生化[17-21]以及品种的抗旱性鉴定[22]等方面，而对不同干旱胁迫以及复水后新疆大叶苜蓿光合生理及荧光特性影响的相关研究较少。本研究通过对1年生新疆大叶苜蓿干旱胁迫及复水的处理，探究其光合作用和叶绿素荧光的变化规律，揭示新疆大叶苜蓿对不同干旱胁迫和复水条件下的光合生理响应机制，以期为新疆大叶苜蓿的水分高效利用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
本研究以甘肃农业大学草业学院提供的新疆大叶苜蓿种子为实验材料。
1.2 试验设计
采用盆栽试验，在室外自然条件下进行。每个花盆(上底直径29.5 cm，下底直径20.0 cm、高23.0 cm)装8.0 kg过筛(筛孔为0.5 cm)的壤土，在装土前，每盆增施7.2 g氮肥，氮肥的比例为1∶5[1 g尿素+5 g(NH4)2HPO4]混合均匀，测得田间持水量为18.25%。2021年3月15日播种，每盆播种50粒，出苗后定苗至20株，统一防治病虫害。
试验共设3个不同的土壤水分梯度，即CK为对照(田间最大持水量的75%±5%)、T1为轻度胁迫(田间最大持水量的55%±5%)、T2为重度胁迫(田间最大持水量的35%±5%)，用盆栽称重法控制土壤含水量。待紫花苜蓿长势一致后，于2021年6月25日分别进行干旱处理，当处理组的土壤含水量下降至试验设计要求时，进行干旱处理，7 d后进行复水至对照水平。分别测定在干旱第7 d、复水后第3 d、第5 d和第7 d时新疆大叶苜蓿的叶绿素含量、光合参数和叶绿素荧光参数。试验期间每隔1 d用电子秤在18:00时称重补水，降雨天用塑料棚遮盖防雨。
1.3 试验方法
1.3.1叶绿素含量的测定 采用研磨提取法[23]测定新疆大叶苜蓿叶绿素含量，在早上7:00采取枝条中间新鲜叶片，装入自封袋后放入冰盒内带回实验室，用分光光度计在663 nm和645 nm波长下测定吸光度(A)，测定的指标包括：叶绿素a(Chlorophyll a，Chla)、叶绿素b(Chlorophyll b，Chlb)、叶绿素(a+b) [Chlorophyll (a+b),(Chl(a+b)]。公式如下：
chla=12.72×A663-2.59×A645
(1)
chlb=22.88×A645-5.03×A663
(2)
chl(a+b)=20.29×A645+8.05×A663
(3)
1.3.2光合参数的测定 在上午9∶00-11∶00，选取叶片方向、大小及长势均一致且无病虫害的新疆大叶苜蓿叶片用Li-6400光合仪测定，重复3次。试验期间设定PAR为1 400 μmol·(m2·s)-1，CO2浓度为400 μmol·mol-1，空气流速500 μmol·mol-1。测定指标包括：净光合速率(Net photosynthetic rate，Pn)、胞间二氧化碳浓度(Intercellular CO2concentration，Ci)、气孔导度(Stomatal conductance，Gs)和蒸腾速率(Transpiration rate，Tr)等气体交换参数，并以Pn/Tr计算瞬时水分利用效率(Water use efficiency，WUE)。
1.3.3叶绿素荧光参数的测定 在早上8∶00选取健康、长势一致的叶片进行暗适应30 min，分别采用调制叶绿素荧光仪(PAM-2500)，测定新疆大叶苜蓿的叶绿素荧光参数，每次选取叶片重复3次。测定参数包括：初始荧光(Minimal fluorescence，Fo)、最大光化学效率(Maximal PSⅡphotochemical efficiency in the dark，Fv/Fm)、电子传递速率(Apparent electron transfer rate，ETR)、光化学淬灭系数(Photochemical quenching coefficient，Qp)、非光化学淬灭系数(Non-photochemical quenching，NPQ)和实际光化学量子产量(Actusal photochemical efficiency，Yield)。
1.4 数据处理
采用Excel 2010进行数据计算和图表绘制，采用IBM SPSS Statistics 20进行方差分析(Duncan)。
2 结果与分析
2.1 干旱胁迫及复水对新疆大叶苜蓿叶绿素含量的影响
干旱胁迫及复水使新疆大叶苜蓿叶绿素a的含量呈现先下降后升高的趋势(图1A)。在干旱胁迫7 d时，与CK相比，T2处理与CK相比有显著性差异(P<0.05)，且T1和T2处理下叶绿素a的含量降幅分别为12.0%和35.3%，复水第3 d时，新疆大叶苜蓿各处理之间差异不显著，且呈现T1>CK>T2的趋势。到复水第5 d和第7 d时，T1和T2处理下其叶绿素a的含量都高于CK，均出现超补偿效应。
新疆大叶苜蓿叶绿素b的含量随着干旱胁迫及复水时间的变化总体呈现先下降后增加的趋势(图1B)。干旱胁迫7 d时，随着胁迫不断加剧，其叶绿素b的含量逐渐降低，与CK相比，T1和T2处理下叶绿素b的含量降幅分别为42.3%和59.0%，且各处理之间相比均有显著差异(P<0.05)；在复水第3 d时，与CK相比，T1处理下叶绿素b的含量增幅为16.7%，且各处理之间无显著性差异；在复水第7 d，T1和T2处理均出现超补偿效应，变化趋势为T2>T1>CK，且T2处理与CK相比有显著差异(P<0.05)。
如图1C所示，随着干旱胁迫加剧，与CK相比，新疆大叶苜蓿的叶绿素总量在T1、T2处理下呈现下降的趋势，降幅度分别为23.7%和44.4%，且各处理与CK相比差异显著(P<0.05)。复水3 d时，各处理间叶绿素总量值均增加，且呈现出T1>CK>T2的趋势，与CK相比，其叶绿素总量在T1处理时明显增加，且高于对照水平。随着复水到第5 d和第7 d时，新疆大叶苜蓿各个处理的叶绿素总量均高于对照，均出现了超补偿效应。
2.2 干旱胁迫及复水对新疆大叶苜蓿光合参数的影响
由图2A可知，干旱胁迫及复水对新疆大叶苜蓿Pn产生了显著的影响。在干旱胁迫7 d时，与CK相比，各个胁迫处理的Pn整体变化状态都呈现下降趋势，其中T1和T2处理下降幅度分别为33.3%和62.2%，且各处理之间差异显著(P<0.05)。在复水3 d后，各个胁迫处理的Pn都有所回升，但仍显著低于对照。而复水第5 d和第7 d时，新疆大叶苜蓿的Pn得到了一定的恢复，其Pn在各处理间均表现为T1>CK>T2，且在第7 d时各处理之间差异显著(P<0.05)。
由图2B可知，新疆大叶苜蓿的Ci值随着干旱胁迫及复水时间的变化波动较大。在干旱7 d时，且各处理间差异显著(P<0.05)，与CK相比，T1和T2处理的下降幅度为26.1%和39.7%。在复水第3 d和第5 d时，与CK相比，新疆大叶苜蓿的Ci值在T1处理时显著增加，分别为CK的15.5%和9.8%，且T1与各处理之间差异显著(P<0.05)，出现了一定程度的恢复。复水第7 d时各个处理均高于CK，且新疆大叶苜蓿各处理间与CK相比分别增加了12.2%和15.2%，表现出超补偿效应。
由图2C可知，随着干旱胁迫及复水时间的变化，其Tr总体呈现先减小后增加的趋势。在干旱胁迫7 d时，各处理之间具有显著差异(P<0.05)；复水3 d后，其Tr有所增加，且与干旱胁迫第7 d时相比，T1和T2各处理分别增加了31.6%和60.7%，且表现为CK>T1>T2,且各处理之间差异不明显。到了复水第5 d后，新疆大叶苜蓿的Tr出现了补偿效应，表现为T1>CK>T2，且各处理间差异不明显；复水7 d后，各个处理的Tr均有所上升，表现为T1>T2>CK，各处理之间无差异显著。
图1 干旱胁迫及复水对新疆大叶苜蓿叶绿素含量的影响Fig.1 The effects of drought stress and rewatering on chlorophyll content of Medicago sativa cv. xingjiangdaye注：不同小写字母表示不同处理间差异显著(P<0.05)，下同Note:Different lowercase letters indicate a significant difference among different treatments at the 0.05 level. The same as below
图2D表明，随着干旱胁迫及复水时间的变化，新疆大叶苜蓿的WUE总体呈现先增加后减小的趋势。在干旱胁迫7 d时，CK与T1、T2处理之间差异显著(P<0.05)，且表现为CK
由图2E可知，干旱胁迫及复水对新疆大叶苜蓿的Gs都产生了显著影响。干旱胁迫条件下，各个胁迫处理的Gs呈下降趋势，表现为CK
图2 干旱胁迫及复水对新疆大叶苜蓿光合参数的影响Fig.2 The effects of drought stress and rewatering on photosynthetic parameters of Medicago sativa cv. xingjiangdaye
2.3 干旱胁迫及复水对新疆大叶苜蓿叶绿素荧光参数的影响
由图3A可知，新疆大叶苜蓿在干旱胁迫7 d时，随着胁迫程度的加剧，Fv/Fm呈现缓慢下降趋势，且各处理之间差异显著(P<0.05)，与CK相比，下降幅度分别为5.4%和10.0%；在复水第3 d和第5 d时，呈现出CK>T2>T1的规律，与CK相比，新疆大叶苜蓿在T1处理出现下降的趋势，且下降幅度分别为2.8%和7.6%。到复水第7 d时，表现为T1>CK>T2的规律，且T1处理的Fv/Fm高于CK，并出现超补偿效应。
由图3B可知，随着干旱胁迫及复水时间的变化，新疆大叶苜蓿ETR总体变化趋势呈现先减小后增加的趋势。胁迫7 d时，与CK相比，新疆大叶苜蓿在各处理间差异显著；到了复水3 d时，且呈现T1
由图3C可知，干旱胁迫及复水条件对Fo的影响总体表现为先上升后下降的趋势。干旱胁迫7 d时，随着胁迫程度的加深，新疆大叶苜蓿的Fo逐渐升高，其在T2水平下与CK相比差异显著(P<0.05)。随着复水时间的延长，复水第5 d时，新疆大叶苜蓿的Fo逐渐降低，且各处理之间无显著性差异。在复水第7 d时，Fo表现为CK>T2>T1的规律，说明新疆大叶苜蓿的Fo已完全恢复。
如图3D所示，新疆大叶苜蓿的NPQ随着干旱胁迫的加剧，总体变化趋势为逐渐减小。在干旱胁迫7 d时，随着干旱胁迫的增加，NPQ持续上升，各处理与CK之间形成显著性差异(P<0.05)。在复水第3 d时，NPQ在T1处理下出现明显降低，呈现T2>CK>T1的趋势。复水7 d后，各个胁迫处理的NPQ都低于CK，单因素方差分析表明，各处理组间均无显著差异。
由图3E可知，随着干旱胁迫的加剧及复水时间的延长，新疆大叶苜蓿的Qp总体呈现上升的趋势。在胁迫7 d时，T2处理与CK相比差异显著，且下降幅度为22.6%。在复水3 d时，与CK相比，新疆大叶苜蓿各处理水平差异显著，且呈现CK>T1>T2的趋势。复水第5 d和第7 d时，新疆大叶苜蓿各处理间差异不显著，呈现出T1>T2>CK的规律，并达到了恢复和补偿效应。
如图3F所示，干旱胁迫及复水对Yield的影响总体表现为先下降后上升的趋势。干旱胁迫7 d时，新疆大叶苜蓿的Yield随着土壤干旱胁迫程度的加剧而逐渐降低，CK与T1、T2处理之间差异显著(P<0.05)，而复水第3 d时，CK与各处理之间均有显著性差异(P<0.05)，在复水第5 d时各处理之间无显著性差异。在复水第7 d时，新疆大叶苜蓿的Yield呈现T1>CK>T2的规律，与干旱第7 d时相比，T1和T2各处理分别增加了43.4%和59.8%。
图3 干旱胁迫及复水对新疆大叶苜蓿荧光参数的影响Fig.3 The effects of drought stress and rewatering on fluorescence parameters of Medicago sativa cv. xingjiangdaye
3 讨论
叶绿素是植物进行光合作用的主要色素，植物叶片内叶绿素含量的高低在一定程度上可以衡量植物抗逆性强弱[24]。有研究表明，干旱胁迫通过影响叶绿素的合成导致叶绿体超微结构损伤，使叶绿素含量降低[25]。本研究发现，新疆大叶苜蓿Chla,Chlb和Chl(a+b)随着干旱胁迫的加剧呈逐渐降低的趋势，复水后T1和T2处理均有所恢复，并存在显著的补偿效应，表明新疆大叶苜蓿在经过干旱胁迫后复水可以通过自身调节机制促进其叶绿素的生物合成，使叶绿素含量增加。该结论与林伟通[26]、李洁[27]的研究结果相似。但也有研究者在小麦(Triticumaestivum)[28]、大花紫薇(Lagerstroemiaspeciosa)与毛萼紫薇(Lagerstroemiabalansae)[29]上得出相反的结论，在轻中度干旱胁迫下，其叶绿素含量升高或不变，说明有些植物在生长发育过程中，其水分含量保持在一定的阈值范围内，干旱胁迫不但对叶绿素含量不造成影响，还能促进叶绿素含量的提高，其可能原因是受干旱胁迫时间长短的影响，长时干旱胁迫下叶片扩展生长受阻，产生浓缩效应导致[28]。
植物的光合性能在受到干旱胁迫后明显下降，且随着胁迫的不断加重，光合性能下降愈快，但复水后能够产生一定的补偿效应[30]。研究发现，在轻度干旱胁迫下，引起植物光合作用降低的原因主要是受气孔限制，在重度干旱胁迫下，非气孔因素起主要作用[31]。植物在受到干旱胁迫时，通过降低蒸腾作用、关闭气孔，从而使光合速率降低。本研究发现,在T1和T2处理水平下，随着Pn下降，Ci也随之降低，因此认为在T1和T2处理下，气孔因素是光合作用降低的主要原因。新疆大叶苜蓿在复水之后，在T1处理水平下Pn和Ci值均恢复至对照水平，甚至出现了等量补偿和超补偿效应，这与杨文权等[2]对小冠花的研究结果相似，说明新疆大叶苜蓿对水分条件的变化适应性较强。在T2处理下，新疆大叶苜蓿叶片的Pn恢复不明显，说明重度干旱胁迫对新疆大叶苜蓿叶片的细胞膜结构造成了损伤，导致复水后叶片恢复能力减弱。随着干旱胁迫的加剧，新疆大叶苜蓿的Tr和Gs逐渐降低，说明新疆大叶苜蓿受到干旱胁迫后，可以通过降低Tr和Gs来减少体内水分的散失，从而维持较高的光合强度，这与前人对鼓竹节(Bambusatuldoides‘Swolleninternode’)[32]、野生酸枣(Ziziphusjujubavar.spinosa)[33]和沙地云杉(Piceamongolica)[34]的研究相似。随着复水时间的延长，新疆大叶苜蓿Tr和Gs均逐渐恢复至对照，主要是由于轻度胁迫对新疆大叶苜蓿的叶片造成的损伤是可逆的，在胁迫解除后Tr和Gs均能迅速恢复。对于WUE的研究结果表明：随着土壤水分胁迫的加剧，新疆大叶苜蓿WUE逐渐升高，主要是由于气孔开度减小，蒸腾速率降低速率大于净光合速率升高的速率，导致WUE升高，在复水之后，WUE能够逐渐恢复，说明新疆大叶苜蓿有极强的抗旱性。
叶绿素荧光是研究植物光合作用的有效探针，可以有效地监测植物对逆境的光化学反应机理，从而可以更全面地分析植物的光合作用过程[35]。叶绿素荧光参数对逆境胁迫非常敏感，可以反映叶片对光能的吸收、传递和转换等情况[36]。Fv/Fm表示PSⅡ最大光合量子产量，反映植物的光合潜能。逆境胁迫会使Fv/Fm值降低。ETR可作为植物光合电子传递速率快慢的相对指标，Qp在一定程度上反映了PSⅡ反应中心的开放程度[37]，本研究发现，随着干旱胁迫程度的加剧，新疆大叶苜蓿的Fv/Fm,ETR和Qp均降低，表明干旱胁迫会使新疆大叶苜蓿的PSⅡ反应中心受损，从而抑制光合电子的传递过程，影响光合电子的传递效率。随着复水时间的延长，Fv/Fm、ETR和Qp仍能有效恢复，说明新疆大叶苜蓿的叶片在干旱胁迫解除后，受损的PSⅡ反应中心得到了修复，表明幼苗并未受到不可逆的损伤。Fo是PSⅡ反应中心处于完全开放时的荧光产量。Fo升高表示光合中心遭到了伤害，进而产生光抑制现象[38]。NPQ是PSⅡ处调节性能量耗散的量子产量，通过热耗散消吸收过剩的光能，对植物光合机构免受破坏起到积极的作用[39]，是光保护的重要指标。本研究发现，新疆大叶苜蓿的Fo和NPQ随着干旱胁迫的加剧均逐渐上升，说明新疆大叶苜蓿在受到干旱胁迫时PSⅡ反应中心活性降低，这是植物的一种保护机制。复水后新疆大叶苜蓿的Fo和NPQ均恢复至对照水平，说明新疆大叶苜蓿的叶片PSⅡ天线色素吸收的能量流向光化学的部分减少，以热耗散和荧光形式散失的能量增加，通过提高NPQ及时耗散了过剩的光能，起到保护光合机构的作用。
Yield反映的是光下叶片的实际光能转换效率，即用于光化学反应所占PSⅡ吸收光能的比例[40]。本研究发现新疆大叶苜蓿的Yield随着土壤干旱胁迫程度的加剧而逐渐降低，表明不同土壤干旱胁迫使得其PSⅡ反应中心损,抑制了光合作用的原初反应,这与汤飞洋[41]对4个杜鹃品种叶绿素荧光参数的研究结果相似。复水后不同土壤干旱胁迫处理下的新疆大叶苜蓿Yield值不断升高，在复水第7 d时T2出现了补偿现象，这可能是土壤干旱胁迫对新疆大叶苜蓿造成的损伤是可逆的，其PSⅡ反应中心损及时调整自身光保护机制，使得其Yield逐渐恢复。
4 结论
随着土壤水分胁迫的加剧，新疆大叶苜蓿的Chla,Chlb和Chl(a+b)含量均逐渐下降，复水后，新疆大叶苜蓿的叶绿素各指标均恢复至对照水平，说明干旱胁迫后复水可以促进新疆大叶苜蓿叶绿素的合成。干旱胁迫降低了Pn,Ci,Tr,Gs,Fv/Fm,ETR,Qp和Yield，同时提高了WUE,Fo和NPQ，复水后出现等量补偿和超补偿效应，反映出新疆大叶苜蓿幼苗具有较强的适应性和自我调节能力。
