燕麦根腐病拮抗菌的筛选及抑菌特性研究

2022-06-02金艳丽兰晓君李昌宁马亚春

草地学报 2022年5期

金艳丽，姚拓，兰晓君，李昌宁，马亚春

(甘肃农业大学草业学院，草业生态系统教育部重点实验室，甘肃兰州 730070)

燕麦(AvenasativaL.)是一种粮饲兼用的世界性栽培作物，作为优质饲料，其具有可消化纤维含量高，适口性好，易青贮等特点，在畜牧业发展方面发挥着重要作用[1]，作为营养保健食品，具有降压降糖降胆固醇、改善血液循环的功效，可维护人体的正常机能[2-3]。随着近年来人们对燕麦营养价值的研究不断深入,燕麦需求量和种植面积逐年增加，燕麦病害也大面积的发生。根腐病是植物病害中危害最严重的土传根部病害之一，该病极易感染、发生范围广，严重时可导致作物减产甚至绝收。由镰刀菌引起的燕麦根腐病在国内大多数省份均有出现，严重影响了燕麦的产量和品质。目前根腐病的防治的主要依靠化学农药，长期不合理的施用化学农药，引发了人民对食品安全的担忧，并造成土壤环境污染等问题，此外部分农药能杀死土壤中有益微生物，破坏了植物根际微生境，造成作物减产等问题[4]。2015年，我国制定了化肥、农药使用零增长计划，使得寻求安全无污染的作物病害防治措施成为当今研究的热点之一[5]。

生物防治是一种安全有效且对环境友好的病害防治途径[6]。在植物根际土壤和植物体内分布着种类繁多的有益微生物，包括细菌、真菌和放线菌等，这些微生物能够通过多种直接或间接机制对植物的生长产生积极作用，其中生防细菌作为根际微生物中重要的类群，在植物病害的生物防治中被广泛研究[7]，生防细菌在与植物协同进化过程中形成互利共生关系，通过拮抗、竞争、诱导等方式发挥其生防特性[8]。生防细菌在作物根腐病上的防治已有较多报道，例如，赵晓霞[9]等从盐碱土壤中分离出一株枯草芽孢杆菌，对黄芪根腐病具有良好的防治作用；刘莎莎[10]等从紫花苜蓿根际土壤中分离出2株芽孢杆菌，对紫花苜蓿根腐病有较好的防治效果；郭荣君[11]等利用芽孢杆菌制成的菌剂对小麦根腐病的防治效果可达46.8%。目前，国内针对燕麦根腐病的生物防治研究报道较少。因此，分离筛选可以抑制燕麦根腐病的生防菌株并对其特性进行研究，对燕麦根腐病防治具有极其重要的现实意义。

课题组前期以燕麦根腐病病株为材料，分离出5株致病真菌并进行了致病性测定和分类学鉴定，其中以禾谷镰刀菌致病性最强[12]。筛选对燕麦根腐病具有防效的生防菌是实现该病害生物防治的前提，探究其生防特性可为植物生物防治提供理论基础，本研究拟从生长健康的燕麦根际分离生防菌，并将课题组前期筛选出的生防菌株纳入研究对象，通过拮抗实验筛选出对禾谷镰刀菌致病性有明显抑制作用的菌株，测定其生防特性以及代谢产物的抑菌活性，确定菌株的主要抑菌作用，评估菌株的生防潜力，以期为燕麦根腐病的生物防治提供优良的菌种资源，为燕麦的绿色可持续生产提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1供试植物材料燕麦植株：2020年5月采自甘肃省通渭县燕麦种植大田(105°24819′E，35°24558′N，海拔高度2 293 m)，采用五点取样法，选择长势良好的健康植株，将根连同根系土壤完全混合，装入无菌自封袋中，低温运输至实验室，48 h内进行样品处理。

1.1.2供试菌株供试病原菌：禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)、尖孢镰刀菌(F.oxysporum)、茄链格胞菌(Alternariasolani)，由甘肃农业大学草地微生物实验室提供。

供试生防菌：菌株CCM、LM-1、LSH11、TQF-1、TQF-2、TQF-3、TZF-1，由甘肃农业大学草地微生物实验室提供。

1.1.3培养基 LB培养基；PDA培养基；铬天青(CAS)培养基；蛋白酶检测培养基；纤维素酶检测培养基：淀粉酶检测培养基；脂肽发酵培养基[13-17]。

1.2 方法

1.2.1生防菌的分离与纯化抖落燕麦根系附着的土壤，称取根系及其根际土壤分别加入盛有无菌生理盐水的三角瓶中，摇床震荡30 min(180 r·min-1)，静置几分钟后吸取1 mL菌悬液加入盛有9 mL灭菌生理盐水的试管中，制得浓度为10-1的稀释液，再依次稀释制得10-2，10-3，10-4，10-5梯度稀释液，将各梯度进行涂布，放入30℃恒温培养箱中培养24 h。待平板长出单菌落后，挑取单菌落进行纯化培养，4℃保存备用。

1.2.2菌株初筛采用平板对峙法[18]，以禾谷镰刀菌为指示菌，点接于PDA培养基中央，采用十字交叉法将分离的菌株点接于距培养基中心位置2 cm处，以单接病原菌的平板做对照，在30℃的条件下恒温培养3～5 d，待对照的真菌长满平板后，测量抑菌带宽度，每个处理做3次重复，挑选抑菌效果较好的菌株进行编号并保存。

1.2.3抗菌谱的测定将初筛的拮抗菌株分别与尖孢镰刀菌、禾谷镰刀菌、茄链格胞菌3种病原菌进行平板对峙,将病原菌点接于PDA培养基中央，将拮抗菌以十字交叉法点接于距培养基中心位置2 cm处，以只接病原真菌的处理做对照，在30℃的条件下恒温培养3～5 d，待对照的真菌长满平板后，测量抑菌带宽度，每组处理3次重复。

抑菌率(%) =(对照菌落直径-处理菌落直径) /对照菌落直径×100%。

1.2.4嗜铁素的定性和定量测定定性测定：将初筛菌株点接于铬天青检测培养基中心位置，在28℃下培养3～5 d，观察菌株周围是否有黄色晕圈的产生。每个处理3次重复，根据黄色晕圈的大小，筛选出产嗜铁素能力较强的菌株进行产嗜铁素的定量测定。

定量测定参照何翔[19]的方法：将产生较大晕圈的菌株接入无铁查氏液体培养基，在28℃,150 r·min-1的条件下培养48 h后，取4 mL菌液用0.22 μm的无菌滤膜过滤后，加入等体积的CAS检测液混合，静置1 h后测定其在 630 nm下的波长，记作“As”，空白培养基的OD630作为做对照，记作“Ar”。每组重复3次，计算出嗜铁素的相对含量：

Su=(Ar-As)/Ar×100%

1.2.5溶菌酶的定性测定纤维素酶的定性：采用刚果红显色法，将菌株点接于纤维素酶检测培养基，每个处理3次重复，放入培养箱30℃培养2天后，取出培养基加入1 mg·mL-1的刚果红染液，染色1 h后倒掉染液，再加入1 mol·L-1的氯化钠溶液脱洗30 min，倒掉溶液后观察菌体周围是否有脱色圈的产生。

蛋白酶的定性：用接种环将纯化好的拮抗细菌接种在蛋白酶检测培养基平板上，每个处理3次重复，放入培养箱中30℃培养 72 h，观察是否有透明圈的产生。

淀粉酶的定性:用接种环将纯化好的拮抗细菌点接于配置好的培养基平板，每个处理3次重复，于37℃条件下倒置培养7 d后，取出培养皿加入1 mg·mL-1的碘液，让其显色1 h后倒掉培养皿中的碘液。观察菌体周围是否有脱色圈形成。

1.2.6溶菌酶的定量测定根据产酶特性对拮抗菌株进行复筛，将产生透明圈较大的菌株进行定量测定，蛋白酶的定量测定采用福林酚法，纤维素酶和淀粉酶的酶活力的定量采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法[20]。

1.2.7脂肽类物质的提取及其抑菌活性检测利用酸沉淀法，将菌液上清液用盐酸沉淀，用甲醇少量多次的萃取，最后利用旋转蒸发仪进行蒸发，得到脂肽类粗提物[21]。采用滤纸片法测定脂肽粗提物的抑菌谱[22]。将真菌接在PDA平板中央，在距离真菌2.5 cm处的等角放置3个灭菌滤纸片，吸取10 μL脂肽粗体物于滤纸片上，以等量无菌水作对照，在30℃的条件下恒温培养3～5 d，待对照的真菌长满平板后，测量抑菌带宽度，每组处理3次重复。

1.2.8菌株的鉴定采用16S rDNA基因序列分析法，用细菌基因组DNA提取试剂盒(北京索莱宝生物科技有限公司)提取DNA，利用生工生物工程股份有限公司合成16S rDNA通用引物27F/1492r。合格后送北京奥科生物有限公司测序。在EZBiocloud网站(www.ezbiocloud.net/) 用16S-based ID进行比对分析，选择序列相近模式菌株的16S rDNA序列下载，用MEGA 7.0.17软件，以邻近法构建系统进化树。

1.3 数据处理

采用Excel 2007进行数据整理及制图,采用SPSS 24.0进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 生防菌的分离筛选

燕麦根系和根系土壤共分离纯化出23株细菌，通过平板对峙实验，筛选出4株对禾谷镰刀菌有较强抑制作用的菌株，其中2株分离自燕麦根系，2株分离自根际土壤。实验室前期分离的7株生防菌对禾谷镰刀菌都有较强的抑制作用，因此总共筛选出11株(表1)可以抑制禾谷镰刀菌的菌株，用于后期生防潜力的测定。

表1 菌株编号及来源Table 1 Strain number and source

2.2 菌株抑菌谱的测定

对11株拮抗菌株进行抑菌谱测定。发现11株菌对三株病原菌都有不同程度的抑制作用，对所测病原菌抑菌范围在41%～73%之间，其中对禾谷镰刀菌抑制效果最强的菌株是R1,抑菌率达到72.92%，对茄链格孢菌抑菌效果最明显的是菌株TZF-1，抑菌率达到73.5%，对尖孢镰刀菌抑菌效果最好的是菌株CCM，抑菌率达到69.22%。其中TZF-1、CCM、R1、LSH11的抑菌效果较好，抑菌率均达到67%以上(表2)。

表2 不同拮抗细菌对致病菌的抑菌活性Table 2 Antifungal effects of antagonistic bacteria on pathogens

2.3 铁载体的定性与定量测定

对菌株进行铁载体定性测定，培养5 d后发现有4株菌周围出现较大的黄色晕圈(图1)，其他菌株晕圈较小或没有晕圈，表明这4株菌分泌铁载体的活性最强，因次将这4株复筛菌株进行产铁载体能力的定量测定(表3)，铁载体活性最高的是LSH11，铁载体活性为68.26%，其次是R1，铁载体活性为59.57%，CCM产铁载体能力最弱，各菌株分泌铁载体的能力差异显著。

图1 CAS蓝色平板检测结果Fig.1 Test results of siderophore production in the CAS blue plates

表3 不同拮抗细菌产铁载体的能力Table 3 Siderophore-producing activity of antagonistic bacteria

2.4 水解酶的定性测定

利用选择性培养基检测生防菌分泌几种酶的活性，产生透明圈代表菌株次生代谢物中含有相应的酶，透明圈较大的处理代表产酶能力较强，以产生透明圈大小为指标，复筛出综合产酶能力较强的4株菌，这几株菌能同时在不同的培养基上能够产生较大的透明圈(图2)，后续用于酶活性的定量测定。

2.5 水解酶的定量测定

筛选出的4株可同时产蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶的生防菌，对其进行定量测定，结果如下(表4)，菌株R1产蛋白酶能力最强，蛋白酶活性可达70.12 U·mL-1，显著高于其他菌株，菌株CCM产纤维素酶能力最强，纤维素酶活性可达22.28 U·mL-1，显著高于其他菌株，菌株LSH11产淀粉酶能力最强，淀粉酶活性可达167.26 U·mL-1，显著高于其他菌株，各菌株之间产酶能力差异显著。

图2 淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶平板检测Fig.2 Plate detection of amylase,cellulase and protease

表4 不同拮抗细菌的水解酶活性Table 4 Hydrolase activity of antagonistic bacteria

2.6 脂肽类物质的提取及其抑菌活性检测

脂肽粗提物对禾谷镰刀菌有明显的抑制作用，其中菌株R1的抑菌效果最好，抑菌率达到63.92%，显著高于其他菌株，菌株LSH11对茄链格孢菌的抑制率最高，抑菌率可达68.65%，显著高于其他菌，菌株R1和LSH11对尖孢镰刀菌的抑制作用最强，抑菌率高于50%，显著高于菌株CCM和TZF-1。

表5 脂肽粗提物对致病菌的抑制作用Table 5 Inhibitory effect of lipopeptide roughty on pathogenic bacteria

2.7 菌株的鉴定

将测序结果在EzBioCloud上用16S-based ID进行比对分析，发现与菌株R1亲缘关系最近的菌为贝莱斯芽孢杆菌，用MEGA 7.0.17软件，邻近法构建系统进化树，菌株R1和贝莱斯芽孢杆菌构成一个分支，结合形态学分析，初步鉴定菌株R1为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)，根据比对结果和进化分析，结合形态学分析，鉴定菌株LSH11为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，菌株TZF-1萎缩芽孢杆菌(Bacillusatrophatus),菌株CCM为皮尔瑞俄类芽孢杆菌(Paenibacilluspeoriae)。

图3 菌株16SrDNA基因序列同源性构建的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree constructed by homology of 16SrDNA gene sequences

3 讨论

本研究以燕麦根腐病的致病菌禾谷镰刀菌为靶标菌，筛选出11株对禾谷镰刀菌有明显抑制作用的生防菌，抑菌率为47.5%～72.92%，同时对尖孢镰刀菌和茄链格孢菌也有较强的抑制作用，抑菌率为41.02%～73.5%，说明这几株菌具有广谱抑菌性。但是将平板对峙实验结果作为生防菌筛选的主要依据具有一定的局限性[23]，结合生防机制进行生防菌的筛选，可以提供菌株在生防应用中的理论依据并增加菌株生防成功的可能性[24]，本研究结合菌株分泌铁载体、纤维素酶、蛋白酶等生防特性，对菌株进行了复筛，筛选出4株综合特性良好的菌株，经鉴定分别是枯草芽孢杆菌，贝莱斯芽孢杆菌，萎缩芽孢杆菌和皮尔瑞俄类芽孢杆菌。芽孢杆菌作为微生态环境中的优势种群，因其抗逆性极强，抑菌范围广，在作物病害的生物防治中研究非常广泛。朱海云[25]等从银杏中分离出一株蜡样芽孢杆菌猕猴桃溃疡病的防治效率为93.6%；孙一凡[26]等筛选出两株芽孢杆菌既可增强植物抗病性，又有良好的促生能力。皮尔瑞俄类芽孢杆菌是用于农业生产的微生物新菌种，研究表明其可产生多种抑菌活性物质，如水解酶类、多肽类抗生素等物质[27]。有关皮尔瑞俄类芽胞杆菌防治植物病害已有报道，如陈雅寒[28]报道的一株皮尔瑞俄类芽胞杆菌既可以有效的防治番茄早疫病，还能明显提高番茄产量。

研究表明，生防菌代谢过程中分泌的细胞壁降解酶，可以破坏真菌细胞壁的结构并且溶解菌体，从而抑制真菌的生长[29]。刘洋等[30]分离出的一株芽孢杆菌通过分泌蛋白酶和纤维素酶降解真菌细胞壁中蛋白质和纤维素，破坏病原菌菌丝从而抑制病原菌的生长。铁载体是重要的生防因子，可以通过和病原菌竞争铁元素抑制病原菌的生长[31]，陈伟[32]研究发现病原菌的生长与铁载体浓度有关，铁载体浓度越高对病原菌的抑制效果越明显，铁载体产生菌还可促进种子萌发和幼苗生长[33]，说明铁载体在植物生长和病害防治方面都发挥着重要作用。本研究筛选的4株生防菌对病原菌都有较强的抑制作用，推测其原因，可能是通过竞争作用和溶菌作用抑制病原菌的生长，菌株分泌的酶类物质可破坏病原菌的结构，降解真菌菌丝并导致病原菌的死亡，分泌的铁载体通过和病原菌竞争铁元素，使得病原菌可利用的Fe3+大量减少,从而抑制病原菌生长，菌株合成的铁载体除了给自身和植物提供可利用的铁元素外，还可促进植物对锌和磷等元素的吸收从而促进植物的生长[34]，说明分泌铁载体的生防菌株除了对病原菌具有抑制作用外，还有植物生长促进作用。本实验结果表明菌株LSH11分泌铁载体能力最强，前期研究发现菌株LSH11具有良好的促生特性，其制成的复合菌剂可明显的提高西葫芦的产量，推测其他几株菌也具有良好的促生潜力。后续将展开实验研究几株菌的促生特性并探究其促生作用机制。

脂肽类物质是主要的抗菌物质之一，相较于其他抑菌物质，其理化性质更稳定、抑菌范围更广，对细菌和真菌病原体都可有效的防治[35]。周瑚[36]等从水稻中分离出一株芽孢杆菌，其脂肽类粗提物对真菌的抑制率为14.34%±1.08%,本研究筛选出的4株菌的脂肽类粗提物对三种真菌的抑菌率为12.08%～63.92%，其中菌株R1、LSH11、TZF-1抑菌效果更明显，抑菌率达到40%以上，表明脂肽类物质在抑制真菌的生长中发挥着重要作用，同时脂肽类物质对病原菌的抑制作用具有广谱性。菌株CCM的脂肽类物质抑菌能力较差，但其分泌的铁载体和胞外酶活性都较高，推测菌株CCM是通过其他机生防机制抑制病原菌的生长。本研究筛选获得的4株菌均可分泌与生防相关的代谢产物，如铁载体，溶菌酶，脂肽类等物质，有较好的抑菌作用，有望为燕麦根腐病的生物防治提供菌种资源。