铁坚油杉在NaHCO3胁迫下的生理响应机制

裴春艳，颜玉娟，颜立红,田晓明，向光锋

(1. 中南林业科技大学 风景园林学院,湖南 长沙 410004；2.湖南省自然保护地风景资源大数据工程技术研究中心，湖南 长沙 410004；3. 湖南省植物园,湖南 长沙 410116)

1 引言

根据联合国教科文组织和粮农组织不完全统计，全世界盐碱地面积约9.5438亿hm2，其中我国为9913万hm2[1]。2022年中央一号文件《中共中央国务院关于做好2022年全面推进乡村振兴重点工作的意见》中提出：研究制定盐碱地综合利用规划和实施方案；分类改造盐碱地，推动由主要治理盐碱地适应作物，向更多选育耐盐碱植物适应盐碱地转变。表明选育耐盐碱植物是今后治理盐碱的重要方向之一。我国盐碱地面积大，分布范围广，类型多样[2]，改善盐碱地具有极大的潜在价值。目前关于盐碱地的改良措施中生物措施是最具生态、经济效益的措施[3]，生物措施包括植物种植和微生物改良，在盐碱地上种植绿色植被能够大大改善生态环境。不同植物对盐碱胁迫的耐受程度不同，所以探究盐碱胁迫对植物的影响，了解植物响应机制，对于筛选耐盐植物及开发盐碱地具有重要意义。

铁坚油杉(Keteleeriadavidiana(Bertr.) Beissn.)为松科( Pinaceae)油杉属(Keteleeria)常绿乔木，为我国特有树种，产于我国甘肃、陕西、四川、湖北、湖南、贵州、广西、云南等省区宜生于砂岩、页岩或石灰岩山地[4]，为湖北省省级珍贵植物[5]。铁坚油杉是一种适应范围较广的亚热带地区优良乡土树种，对土壤要求不高，具有菌根，可改良土壤，还能抗干旱、雪压和风折[6]。铁坚油杉适应环境能力较强，能适应生长在干热河谷的特殊气候和土壤条件中[7]，这说明其耐旱性强。各种优良的特性使得探究铁坚油杉的耐盐性具有一定的研究价值。本研究通过盆栽试验法对铁坚油杉进行碱性盐NaHCO3处理，探讨了铁坚油杉在NaHCO3胁迫下的生理响应机制，以期得到大概的耐盐范围，为其引种、推广和应用提供参考。

2 材料与方法

2.1 试验材料

试验材料使用的是湖南省植物园3年生铁坚油杉地栽苗，于2020年11月份上盆于规格一致的花盆(内径22.5 cm，高24 cm)，栽培基质每盆干重3 kg，基质配比为黄心土∶泥炭土∶珍珠岩，体积比3∶1∶1，每盆种植苗木1株。上盆的试验苗放于湖南省植物园苗圃，正常水肥管理至次年7月份。

2.2 试验设计

2021年7月2日在上盆的铁坚油杉中挑选无病虫害、长势好的植株，运至湖南省植物园温室内进行缓苗，待适应环境后开始试验。采用完全随机试验设计，根据预试验结果，设置了5个不同NaHCO3浓度处理：0%(CK)、0.5%、1.0%、1.5%和2.0%，每个处理5盆，每盆1株苗。7月12日正式开始试验，于当天采样后对每盆试验苗采用浇灌法进行相应盐分浓度处理，盐分浓度采取质量百分比配置(0.1% NaHCO3配比为盐∶水=1∶999)，盆底设有托盘，将渗漏的水倒回盆内防止盐分流失(试验期间所用水均为去离子水)。试验共40 d，于第0 d开始采样测试，后每隔10 d采一次样，共5个周期。各周期的采样时间在每天的8:00～9:00，随机采样，指标测试时设置3个重复。

2.3 试验指标测定方法

2.3.1 生长指标测定

形态观测：每5 d进行植株形态观测，每10 d进行拍照记录植株形态上的变化。

株高增长测量：分别在试验0 d和40 d使用精度0.1 cm卷尺测量植株高度。

地径增长测量：分别在试验0 d和40 d使用精度0.01 mm游标卡尺测量植株茎粗。

2.3.2 生理指标测定

采样烘干称重法测量叶片相对含水量[9]。计算公式为：

相对含水量RWC(%)=(自然鲜重-干重)/(饱和鲜重-干重)×100%

(1)

超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮蓝四唑(NBT)光化学还原法测定[9]；丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸比色法测定[10]；脯氨酸(Pro)采用磺基水杨酸法测定[11]；可溶性蛋白(SP)含量采用考马斯亮蓝G-250法测定[12]；光合色素含量采用分光光度法测定[12]。

2.4 数据处理与分析

数据使用Microsoft Excel 2019整理，采用SPSS 22.0系统分析软件对数据进行方差分析，用Origin 2017软件进行作图。

3 试验结果与分析

3.1 NaHCO3胁迫对铁坚油杉形态和生长指标的影响

试验期间进行观察拍照记录发现，NaHCO3处理的植株盐害症状表现为植株叶片失水干枯，挂枝头不脱落，直至植株死亡后掉落。植株盐害症状整体变化趋势：由外至内、由新生叶至老叶。0.5%和1.0%处理组植株均正常生长与CK无差别；1.5%处理组植株在试验期间无盐害症状，试验结束后25 d有2株植株的新生成熟叶片出现盐害症状，后随观察时间的延长，试验结束后30 d有2株植株盐害症状加剧，新生叶片干枯，2株植株出现轻微盐害症状，枝头新生叶片叶色变淡，其余的正常；2.0%处理组下植株有2株在试验30 d时出现轻微盐害症状，后随胁迫时间延长该处理组下的植株均出现盐害症状，试验结束后30 d有1株出现死亡。碱性盐NaHCO3处理的植株盐害症状表现如图1、2。

图1 铁坚油杉局部观察

图2 铁坚油杉整株观察

根据表1分析，随盐浓度的增加，株高增长量先增加后减少，地径增长量逐渐减少，其中0.5%处理组株高增长量相较CK增加了23.8%；2.0%处理组下的株高与地径增长量显著低于CK(P<0.05)，分别较CK下降56.2%和54.8%。这表明0.5%NaHCO3处理下对铁坚油杉的生长有促进作用，但浓度高于1.5%的盐胁迫抑制了植株生长，浓度越大抑制作用越强。

表1 NaHCO3胁迫对铁坚油杉株高和地径的影响

3.2 NaHCO3胁迫对铁坚油杉生理指标的影响

3.2.1 NaHCO3胁迫对铁坚油杉叶片相对含水量(RWC)的影响

根据图3分析，试验至20 d时，2.0%处理组RWC显著低于CK(p<0.05)，且随胁迫时间的延长与CK组差距越来越大，至40 d时该处理组叶RWC极显著低于CK(p<0.01)。1.5%处理组在试验40 d时RWC显著低于CK；其他处理组均匀CK无显著区别。表明NaHCO3胁迫下，浓度超过1.5%的处理组造成了植株水分代谢失衡。这可能是由于高浓度盐环境下渗透胁迫和高pH胁迫共同影响导致根系吸收困难，水分难以供应到植株上部分的枝叶，故试验后期高浓度梯度组RWC显著低于CK。

图3 NaHCO3胁迫对铁坚油杉叶片相对含水量的影响注：不同小写字母表示同一时间不同处理间的差异显著性(P< 0.05),下同

3.2.2 丙二醛(MDA)含量

根据图4分析，各盐胁迫处理组MDA含量整体随胁迫时间的延长呈逐渐递增的变化趋势；在同一周期内，MDA含量随盐浓度的增加而增加。试验至10 d，除2.0%处理组MDA含量显著高于CK(p<0.05)，其余处理组均与CK组无显著相关性(p>0.05)。试验至20 d，除0.5%处理组MDA含量与CK无显著相关性，其余处理组均显著或极显著高于CK。胁迫至30 d和40 d时，1.5%和2.0%处理组MDA含量均极显著高于CK(p<0.01)，其余处理组与CK无显著相关性。

图4 NaHCO3胁迫对铁坚油杉叶片丙二醛含量的影响

3.2.3 超氧化物歧化酶(SOD)活性

根据图5分析，各盐胁迫处理组SOD活性整体随胁迫时间的延长呈先增加后减小的变化趋势。试验至10 d，各盐胁迫处理组SOD活性均高于CK，但无显著相关性(p>0.05)；试验至20 d，除0.5%处理组SOD活性低于CK，其他处理组均高于CK，其中1.5%和2.0%处理组与CK呈显著相关性(p<0.05)；试验至30 d，1.0%和1.5%处理组SOD活性显著高于CK(p<0.05)，2.0%处理组SOD活性显著低于CK(p<0.05)；试验至40 d，各处理组SOD活性均低于CK，其中1.0%和2.0%处理组与CK存在显著相关性(p<0.05)。

图5 NaHCO3胁迫对铁坚油杉叶片SOD活性的影响

3.2.4 脯氨酸(Pro)含量

根据图6分析，各盐胁迫处理组Pro含量随试验时间的延长整体呈增加的变化趋势。试验至10 d，0.5%和1.0%处理组Pro含量低于CK，1.5%和2.0%处理组高于CK，但无显著相关性(p>0.05)；试验至20 d，各盐胁迫处理组Pro含量均高于CK，无显著相关性；试验至30 d，各处理组均高于CK，其中2.0%处理组与CK呈显著相关性(p<0.05)；胁迫至40 d，随盐浓度的增加Pro含量呈逐渐增加的变化趋势，其中1.0%处理组显著高于CK(p<0.05)，1.5%和2.0%处理组均极显著高于CK(p<0.01)。

图6 NaHCO3胁迫对铁坚油杉叶片脯氨酸含量的影响

3.2.5 可溶性蛋白(SP)含量

根据图7分析，试验至10 d，各处理组SP含量均高于CK；试验至20 d，各处理组SP含量随盐浓度的增加而增加，其中1.5%和2.0%处理组极显著高于CK(p<0.01)；试验至30 d，各处理组SP含量随盐浓度的增加先增加后减少，其中2.0%处理组与1.5%处理组呈显著相关性(p<0.05)；胁迫至40 d，1.0%处理组SP含量达到最大，2.0%处理组SP含量小于CK，与1.0%处理组呈极显著相关性(p<0.01)。

图7 NaHCO3胁迫对铁坚油杉叶片可溶性蛋白含量的影响

3.2.6 叶绿素a含量

根据表2分析，CK、0.5%和1.0%处理组叶绿素a含量随胁迫时间的延长整体呈增加的变化趋势，1.5%和2.0%处理组则先增加后减少。试验至10 d，各盐处理组的叶绿素a含量均高于CK，但无显著相关性(p>0.05)；试验至20 d，1.5%和2.0%处理组叶绿素a含量均显著高于CK(p<0.05)；试验至30 d，2.0%处理组叶绿素a含量显著低于CK(p<0.05)，其他处理组均高于CK但无显著相关性；试验至40 d，各项叶绿素a含量随盐浓度的增加先增加后减少，其中1.5%处理组叶绿素a含量显著低于CK(p<0.05)，2.0%处理组叶绿素a含量极显著低于CK(p<0.01)，其他处理组均高于CK。

表2 NaHCO3胁迫对铁坚油杉叶片叶绿素a含量的影响

4 讨论与结论

4.1 NaHCO3胁迫对铁坚油杉生长指标的影响

不同的植物对盐碱的耐受能力不一样，当土壤盐分超过植物的耐受能力会抑制植物的生长，严重的话会造成植物死亡。植物受到盐害最直观的表现是叶、茎等表观形态的变化。本研究中铁坚油杉在高浓度NaHCO3胁迫表现了明显的盐害反应，叶出现失水现象，后随胁迫时间延长干枯，最终致植物死亡。铁坚油杉在生长中也受到了抑制，地径增长量随盐浓度的增加逐渐减少，2.0%处理下株高和地径增长量都显著的低于CK。有研究[13]指出生物在受到胁迫或伤害会出现补偿现象，这是生物对不良环境的一种适应，这种补偿生长效应是植物抵御逆境危害的一种自我体内调节机制。本研究中在0.5%浓度胁迫下株高增长量高于CK，之后随盐浓度的增加而下降，表现出‘低促高抑’现象，这与周贝宁[14]研究夏腊梅在碱性盐胁迫下的生长结论一致。

4.2 NaHCO3胁迫对铁坚油杉生理指标的影响

盐碱化土壤会对植物造成渗透胁迫、离子毒害以及活性氧伤害，同时伴随着高pH值的伤害[15]。而植物在生长过程中应对逆境条件形成一系列的生理响应机制，主要包括合成渗透调节物质、离子区隔化、提高抗氧化酶活性清除活性氧等生理机制。脯氨酸、可溶性蛋白是重要的渗透调节物质，在植物受到胁迫时会增加其含量来抵御不利的生长条件[16]。SOD是保护酶系统中最重要的酶之一，起到清除活性氧的作用，而MDA是植物遭受逆境胁迫后膜脂过氧化的重要产物，MDA含量可以反映植物受伤害程度[17]。盐胁迫下会对植物的光合系统造成损害，叶绿素作为光能吸收、传递和转化的主要物质载体，在光合作用中占有重要地位[18]，叶绿素a的含量可以反应植物在盐胁迫下的伤害情况。本研究中，铁坚油杉在不同浓度NaHCO3胁迫下生理指标变化各不相同。渗透调节物质脯氨酸含量随胁迫时间的延长逐渐增加，在同一时间内也随浓度的增加而增加；可溶性蛋白含量随时间浓度的增加先增加后减少。表明铁坚油杉在盐胁迫下能合成渗透调节物质来抵御外界的渗透压，保证植物的吸水，维持正常生长。但随胁迫时间的延长，活性氧的增加植物已难以清除过多的活性氧来维持平衡，有害离子在植株体内增加，造成活性氧增多累积，从而导致可溶性蛋白被分解，故试验后期高浓度可溶性蛋白含量减少。试验初期，少量的活性氧能被植物体内的抗氧化酶清除，本研究中植株试验前期提高SOD活性清除活性氧，随胁迫时间延长高浓度SOD活性明显下降，原因是过量的活性氧破坏了酶的结构。活性氧的增加破坏了细胞膜，使得MDA含量也在不断增加，本试验中MDA含量随胁迫时间和浓度的增加不断增加，其中高浓度的MDA含量显著高于CK，表明高浓度盐胁迫破坏了植株体内的细胞膜和膜的选择透性功能。NaHCO3胁迫也造成了铁坚油杉光合作用受到影响，试验开始时高浓度组叶绿素a含量较CK组高，试验后前高浓度组的叶绿素a合成明显受到抑制，显著低于CK。表明铁坚油杉在胁迫前期通过合成叶绿素a来增加光合作用，提高植物的有机物积累，从而抵御逆境胁迫，但随后活性氧的增加及MDA的毒害造成叶绿素a合成受到抑制。

综上所述，铁坚油杉对NaHCO3有一定的耐性，能耐低于1.0%质量浓度下的NaHCO3胁迫。但浓度超过1.5%短时间内能通过增加渗透调节物质，提高抗氧化酶活性等生理机制来适应胁迫环境，但长时间的胁迫还是会影响铁坚油杉的生长。