基于数据挖掘及网络药理学探讨中药复方汤剂治疗乙型肝炎的组方规律及分子机制分析*

慢性乙型肝炎(CHB)是世界范围内重大的传染性疾病，全世界估计有2.92亿人感染了慢性乙型肝炎病毒(HBV)

，近年来，干扰素、核苷(酸)类似物以及提高机体免疫功能等治疗方法有很大进展，但核苷(酸)类似物需要长期服药，停药后病情易反弹，患者依从性不佳。干扰素虽然能调节机体免疫，但仍存在副作用较大，抑制病毒复制作用有限等问题

。大量的临床研究表明，中药复方汤剂在改善CHB患者症状、恢复肝功能以及延缓纤维化等方面与单纯使用西药相比有着明显的优势

。但由于CHB患者的体质不同，惯用药物也不同，所以很难把握中药治疗乙型肝炎的整体规律。本研究以中国知网近十年来治疗乙型肝炎随机对照研究(RCT)文献为主体，以中药的性味归经为研究对象，采用数据挖掘及网络药理学方法，总结中药治疗乙型肝炎的规律，并分析其潜在分子机制，旨在为中药治疗乙型肝炎提供新思路。

1 资料与方法

1.1 数据来源 以“乙型肝炎”“中医”“中药”为检索词，检索CNKI数据库中2011年1月1日至2021年4月1日关于中医药治疗乙型肝炎的 RCT文章。

多措并举 创新土地集约利用（黄小珊） ........................................................................................................ 6-50

1.2 处方筛选

1.2.1 纳入标准：①中药复方治疗乙型肝炎的临床随机对照文章；②第一诊断为乙型肝炎；③药味、用法明确；④临床研究治疗有效或能改善患者症状(具有统计学差异，

<0.05)。

金安区耕地级别以社会经济因素与区位因素影响为主，自然因素影响为辅。金安区自然地力条件并不优秀，但因其社会条件，耕地收益水平较高。为此可以在保持自身区位优势的基础上，调整种植业结构，全面优化粮油业，提升瓜果蔬菜业，建好六合路、六舒路、六寿路“三路”生态农业示范走廊，加强农业科技示范园建设。改善耕地培肥情况，在北部山地平原区利用冬闲种植紫云英、鼠茅草等绿肥；与中部丘陵岗地区增施有机肥，推广秸秆还田；在南部低山丘陵区搞好水土保持，利用草场资源发展畜牧业。

1.3 处方录入及预处理 将纳入文献的原始数据(方剂名称、中药名称及剂量)录入Excel 2019表格，再对数据进行预处理，主要包括以下几项内容：修正存在错误的中药名称；参照“十三五”《中药学》和2020版《中国药典》规范并统一中药名称；按照《中国药典》对药物进行分类；按照《中国药典》以及《中药学》确定药物的四气五味及归经。

2.2 性味归经统计与分析 筛选出的药物在四气中所占比重从大到小依次为：寒(90次)>温(83次)>平(48次)>凉(14次)>热(4次)。药物在五味中所占的比重大小依次为：苦(117次)>甘(112次)>辛(88次)>咸(26次)>酸(17次)>淡(11次)>涩(8次)。药物归经按频次从多至少依次为：肝(132)>肺(89)>脾(86)>胃(85)>肾(74)>心(56)>大肠(22)>胆(21)>膀胱(20)>小肠(16)>心包(4)>三焦(3)。

见面的地点定在律师事务所。6 3岁的谢修平比实际年龄更显老，这是乡下人共同的特征。身体还壮实，看不出有什么不便的地方。苏楠握了握他的手，说她代表委托人，谢谢他出来作证。

2.1 频数统计 对于筛选后的472首中药复方进行统计，共有239味中药，所有中药共出现5 034次，使用频次高于100次的有11味中药，其中占比与出现频次见表1。

1.5 网络药理学对药物的深度分析 将Excel 2019中所得到的出现频率前十味的药物，在中医药系统药理学平台(TCMSP)进行中药有效成分筛选，同时通过GeneCards、OMIM、PharmGkb、TTD、DrugBank数据库，使用“Hepatitis B”作为检索词获取乙型肝炎的相关靶标，使用Draw Venny Diagram在线程序构建中药-疾病交集靶点，在 Cytoscape3.8.2中构建药物-疾病-靶基因网络图，并将基因提交至 String 网站绘制蛋白质相互作用关系图(PPI)，并进一步利用Cytoscape3.8.2筛选核心蛋白成分构建PPI网络图，再利用R4.0.5软件进行GO富集分析和KEGG通路富集分析，预测治疗乙型肝炎的最高频药物的可能作用机制。

采用Cochrane协作网提供的Rev Man 5.3统计软件进行Meta分析。以均数差（MD）作为连续性变量的统计量，并计算其95%置信区间（CI）。对纳入研究的异质性进行χ2检验，若各研究间无统计学异质性（P＞0.10，I2＜50%），则采用固定效应模型进行Meta分析；反之，则采用随机效应模型进行Meta分析。当存在临床异质性时，绘制倒漏斗图进行发表偏倚分析。

2 结果

1.4 数据统计以及分析 共下载1 089篇文章，经过筛选后保留472首方剂，使用Excel 2019表格对保留的方剂进行分析，统计中药的频数，筛选高频药物，并对药物的性味归经进行频数分析，初步归纳出乙型肝炎的用药特点及高频药物；运用IBM SPSS Modeler 18进行药物关联规则分析，将最低支持度设定为15%，置信度为80%，最大前项数为5，从而得到处方规律，并挖掘核心药物群。聚类分析：将数据导入至IBM SPSS Modeler 18软件中，针对高频药物，根据功效、性味、归经等进行聚类分析，总结治疗乙型肝炎的核心处方药对。

1.2.2 排除标准：①诊断不明确；②具体处方记录不完整；③方药组成、剂量均相同的处方仅保留最早发表者，其余的均剔除。④非临床数据如动物实验、机制研究等；⑤检索文献中报道患者合并其他疾病如糖尿病、高血压、抑郁症等。

日前，北京建工土木公司以29.85亿元中标目前国内体量最大的地下空间工程——苏州吴中太湖新城地下空间工程，并将依托北京建工建筑技术公司把该工程打造为国内第一个地下空间领域的绿色建筑。

2.3 关联分析与聚类分析

2.3.1 治疗乙型肝炎常用药的关联分析 运用IBM SPSS Modeler 18.0对所有药物用Apriori算法进行关联规则分析，设置最小支持度为15%，置信度为80%，最大前向项数为5，支持度由高到低排序，共得到核心药对16个见表2。治疗乙型肝炎药物的关联网络化展示见图1。

2.3.2 治疗乙型肝炎常用中药的聚类分析 将频数前10位药物列为高频药物，导入IBM SPSS Statistics 25中，对高频药物进行聚类分析，选择聚类方法为组间联合、皮尔逊相关性，最小聚类数5，最大聚类数10，结合中医学相关理论，得到4个中药聚类组合，聚类分析结果见表3、图2。

2.4 网络药理学分析高频药物治疗乙型肝炎的潜在作用机制高频药物的靶标预测结果 将出现频率最高的前十位药物定义为高频药物，使用中药系统药理学数据库分析平台(TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php)检索高频药物的有效成分和作用靶点，并根据口服生物利用度(OB)≥30%以及类药性(DL)≥0.18，除去重复项，筛选出188个化学成分、281个作用靶点。在GeneCards等数据库搜索相关靶标并去重后获得疾病靶点数10 992个，药物与乙型肝炎疾病靶点交集为235个，利用Cytoscape软件构建疾病-药物-活性成分-靶点网络(外圈代表药物成分)，黄色代表活性成分黄芪，紫色代表茵陈，棕色代表白芍，深蓝色代表白术，绿色代表柴胡，红色代表丹参，白色代表茯苓，黑色代表郁金，粉色代表当归，浅蓝色代表甘草，内圈中蓝色代表靶点，靶点越大表明药物对应靶点越多，其中A、B、C、D为中药共有成分，见图3。中药共有成分见表4。利用STRING(https://string-db.org/)数据库获取蛋白互作关系，首先设置PPI网络图设置置信区间为95%以上，并将蛋白互作关系导入Cytoscape软件，再使用CytoNCA进行筛选出其中的核心蛋白，构建构建蛋白互作网络(PPI)，如图4。

通过数据库 Bioconductor(http://bioconductor.org/)对高频药物治疗乙型肝炎作用的靶标进行基因symbol的ID转换，运用R语言的ClusterProfiler、org.Hs.eg.db、enrichplot、ggplot2包进行GO和KEGG富集分析，GO分析共获得涉及 BP(生物学过程)2 633个，CC(细胞组分)126个，MF(分子功能)274个，取前10位药物得到生物功能的气泡图和KEGG通路富集分析的柱状图(图5，6)。其中点越大则富集基因越多，

值越小颜色越红，代表与高频药物组合治疗乙型肝炎关系越密切。主要涉及药物反应、金属离子反应、氧化应激反应等生物过程。KEGG通路富集得出188条信号通路(

<0.05)，取前30条绘制柱状图。其中主要涉及乙型肝炎、白介素-17、巨细胞病毒感染、脂质与动脉硬化等通路见图7，红色代表通路中相关的靶点。其中长度越长代表富集的基因越多，

值越小颜色越红。

3 讨论

3.1 乙型肝炎的中医药治疗以清热解毒、健脾化湿、扶正化瘀为主 慢性乙型肝炎，在中医古籍中并无与之完全对应的疾病，中医治疗多从其引起症状如“黄疸”“胁痛”等进行治疗。谭晓风认为，“黄疸”最早为“瘅”的通假字

，其最早记载在《山海经》中“西水行百里……服之已瘅

”，而医学专著中首次出现“疸”为《黄帝内经》，而后的《难经》也对于黄疸有描述，直至《金匮要略》中确立对于黄疸的基本治法，并将黄疸分为3种基本类型，谷疸、酒疸、女劳疸，其治法大多从清热祛湿为主，处方则多使用麻黄连轺赤小豆汤、茵陈蒿汤、硝石矾石散、栀子大黄汤等方剂，这与数据统计中清热药出现最多的结果相呼应，同时《金匮要略》中也揭示了黄疸病的病机为“黄家所得，从湿得之”，故而治疗乙型肝炎利水渗湿药、化湿药均在前列。然而《金匮要略》中提到：“黄疸之病，当以十八日为期，治之十日以上瘥，反剧为难治”。对于病情迁延的治疗方法，则给出了“寒湿中求之”的原则，因而后世医家在治疗黄疸时，将黄疸分为“阴黄”“阳黄”，亦或是现代医家的新观点“阴阳黄

”，或有医家提出以“卫气营血”论治慢性乙型肝炎发生发展的不同阶段

，故慢性乙型肝炎治疗不能单以清热祛湿，否则疗效不佳。而对于疗程较长，预后不佳的患者，其病机往往与“女劳疸”相似，均为肝肾不足，并有湿热瘀血，其症状“额上黑……腹如水状不治”也与乙型肝炎失代偿期表现极为相似，故现代医家在治疗慢性乙型肝炎时注重补益，进而利水渗湿，并辅以活血化瘀。聚类分析显示，药物组合分别为：白术-茯苓-当归、柴胡-白芍-甘草、丹参-黄芪-郁金、茵陈，反应了健脾利湿，疏肝活血、扶正化瘀，为基本治疗方法。其反映了现代医家治疗慢性乙型肝炎多以扶正为基本方法。蓝青强教授

认为慢性乙型肝炎早期应该以培土健脾胃为主，晚期肝脾肾三脏失调，则需阴阳双补、疏肝健脾；江一平教授

则认为慢性乙型肝炎早期应治以祛邪为主，兼以扶正，中期则肝脾同病，虚实夹杂，故以扶正祛邪，晚期正虚瘀结，以正虚为主，当重用扶正之品，佐以清利余邪，活血化瘀。以上诸多方法都能够从不同的方面有效遏制疾病的进展，提高乙型肝炎患者免疫应答水平，延缓纤维化进展，促进肝功能恢复。数据分析图显示，药物的性味归经以归肝经最多，其次为肺，再次为脾胃与肾经；四气以寒、温为主；五味则以苦、甘为主，反映病位在肝，继而影响脾胃；病性属本虚标实，本虚在肝肾，标实在肝胆脾胃，以湿热为主，湿热日久影响气机，进而成瘀。

3.2 高频药物治疗慢性乙型肝炎的机制 通过数据挖掘发现，中医药治疗乙型肝炎，多以清热利湿，扶正补虚为根本治疗大法，现代医学则认为乙型肝炎的感染慢性化与机体免疫耐受有着密切关系，例如儿童患者发生乙型肝炎慢性化的一种可能是免疫系统不成熟

，而中药治疗的具体分子机制则有待进一步挖掘，利用网络药理学分析，共筛选出高频药物的188个化学成分、280个作用靶点，以关键词“Hepatitis B”搜索，得到高频药物的活性成分与疾病的交集靶点235个，而相关的PI3K-Akt-mTOR、JAK-STAT、JNK等通路则与乙型肝炎的发生、发展、以及人体的免疫系统的生理病理变化具有密切的关系

。通路中的核因子κB(NF-κB)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)等具体靶点则是中药有效成分的研究热点，NF-κB与炎症、细胞凋亡以及肿瘤的发生发展密切相关

，TNF-α则是多种细胞分泌并且引起炎症的一种常见细胞因子；白细胞介IL-6是一种多效性细胞因子，通过调节获得性免疫，在炎症、肝再生和抗感染等方面发挥多种作用

。黄芪多糖能够通过TLR4(Toll-like receptor4)介导的MAPK和NF-κB激活进而上调TNFα、IL-6、iNOS的基因表达

，进而促进巨噬细胞的细胞毒作用，对乙型肝炎患者的免疫系统具有激活作用。此外，黄芪糖蛋白还可能通过抑制神经炎症、减少趋化因子的分泌和细胞黏附而减轻自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的发病

。芍药总苷则拥有多种生物活性，包括抗炎、抗氧化、保护肝脏、抗抑郁、抗肿瘤和调节免疫等作用，其具体调节机制可能是与调节B、T细胞和DC细胞、调节NF-κB、MAPK和PI3K/Akt等信号通路

、抑制免疫细胞的成熟和功能表达及IL-6等炎症因子的释放有关。柴胡皂苷是柴胡的有效成分之一，其有多种分子亚型，具有抗肿瘤，保护肝脏、抗抑郁等作用

，其也能通过调节 PI3K-AKT 以及NF-κB等通路调节免疫功能，抗免疫炎症反应，并且可抑制由肝损伤引起的肝组织以及血清 AST、ALT 水平上升、抑制细胞因子TNF-α与 IL-1β的表达，同时能抑制NF-κB信号途径的激活，从而保护肝细胞，降低肝损伤的程度

。丹参的主要活性成分之一是丹参酮，丹参酮具有多种作用，涉及多种信号通路，包括抗增殖、抗凋亡、抗炎和抗氧化应激等

，其能通过激活细胞外基质酶进而减少细胞外基质的过度沉积而对肝纤维化的发生、发展起防护作用

；丹参酮ⅡA还可在不同浓度梯度下，分别通过不同的作用机制，如影响基质金属蛋白酶2(MMP-2)和基质金属蛋白酶9(MMP-9)的表达、NF-κB、miR30b-p53-PTPN11/SHP2通路、膜流动性，以及对于TGF-β Hippo通路的调节来治疗肝细胞癌

。除此之外，丹参对于肝细胞还具有保护作用，亦可通过适当促进细胞凋亡而减轻肝脏缺血-再灌注损伤

。中药复方的作用机制更加复杂，茵陈与甘草在不同的配比比例下，对于胆汁淤积性肝损伤的作用也有不同，当方剂中甘草用量重而茵陈用量轻时，可显著改善肝细胞的炎症反应、以及血浆总胆汁酸、胆红素、TBil、ALT、AST、ALP活性；而茵陈用量重而甘草用量轻时，则可能加重炎症反应

。综上所述，中药治疗乙型肝炎有多靶点、多通路、多方面治疗的优势，高频药物的组合或许可以成为治疗乙型肝炎的下一个方向。

3.3 本研究的不足之处 课题组初步研究了中国知网关于治疗乙型肝炎的中药复方组方用药规律及高频药物对乙型肝炎患者的作用靶点及通路，为中药成药开发及临床组方用药提供了一定的借鉴意义。在研究过程中，课题组总结出本研究存在以下不足：本次研究的治疗乙型肝炎文献为近10年中国知网的文献总结，后续可继续扩大数据收集范围。其次是因对中药的有效成分研究尚非完全充分，因此本研究结果只能提示高频药物的潜在作用靶点以及可能的作用机制，后续的研究要更全面地揭示中药的作用机制。最后本次研究的高频药物从中医理论来看以疏肝理气、健脾化湿为主，而补虚类的补肾药物则未在高频药物中出现，而有部分现代医家对于补肾法治疗乙型肝炎有独到的经验，后续可再行研究。

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