基于微阵列芯片对三子养亲汤治疗过敏性哮喘的分子作用研究

李欣容 陈鲁 刁翰林 吴金勇

摘要 目的：研究三子養亲汤治疗过敏性哮喘的作用机制。方法：使用GEO2R找到GSE40889芯片的差异基因，利用GCBI数据库制作差异基因热图，借助DAVID6.8对差异基因进行基因本体（GO）富集分析和京都基因和基因组百科全书（KEGG）富集分析，使用Cytoscape构建蛋白质-蛋白质相互作用网络，筛选核心基因，分析网络，再进一步利用Cytoscape的MCODE插件对差异表达基因进行模块分析。结果：共查询有效成分21个，对应靶点268个;筛选出213个差异基因，差异表达基因主要富集在膜组织、RNA结合及转录翻译方面等，涉及通过TNF-α、B细胞受体、TGF-β、PI3K/AKT信号通路。得到一个重要模块，功能主要集中在基因沉默的调控、蛋白质异构化、细胞-细胞黏附、病毒过程等方面及RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、p53介导的内源性凋亡信号通路对DNA损伤的响应、DNA模板、宿主对病毒转录的正调控等，涉及Notch信号通路、FoxO信号通路、PI3K-AKT信号通路等信号通路。结论：三子养亲汤可能通过TNF-α、B细胞受体、TGF-β、PI3K/AKT信号通路，调控基因沉默、使蛋白质异构化，影响转录翻译等途径发挥作用。

关键词 微阵列芯片;三子养亲汤;过敏性哮喘;分子作用;作用通路;网络药理学

Molecular Mechanism of Sanzi Yangqin Decoction on Allergic Asthma Based on Microarray

LI Xinrong1，CHEN Lu2，DIAO Hanlin1，WU Jinyong2

（1 Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Ji′nan 250014，China; 2 Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Ji′nan 250014，China）

Abstract Objective：To study the mechanism of Sanzi Yangqin Decoction in the treatment of allergic asthma.Methods：Gene Expression Omnibus 2R（GEO2R） was used to find the differential gene of GSE40889 chip，and Gene-Cloud Biotechnology Information（GCBI） database was used to make the differential gene heat map.DAVID 6.8 was used to conduct Gene Ontology（GO） and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG） enrichment analyses on the differential gene.Cytoscape was used to construct the network of protein-protein interaction.The core gene was screened out，and the network was analyzed.The module analysis of the differential gene was carried out by the Molecular Complex Detection（MCODE） of Cytoscape.Results：A total of 21 active components were queried，268 corresponding targets were found.A total of 213 differential genes were screened out，which were mainly enriched in membrane tissue，ribonucleic acid（RNA） binding，transcription，and translation，involving signaling pathways of tumor necrosis factor-α（TNF-α），B cell receptor，transforming growth factor-β（TGF-β），and phosphoinositide 3 kinase/protein kinase B（PI3K/AKT）.An important module was obtained，which mainly focused on the regulation of gene silencing，protein isomerization，cell-cell adhesion，virus process，the positive regulation of RNA polymerase II promoter transcription，the response of endogenous apoptosis signaling pathway mediated by tumor suppressor p53 to deoxyribonucleic acid（DNA） damage，DNA template，and the positive regulation of host to virus transcription，involving signaling pathways of Notch，forkhead box O（FoxO），and PI3K-AKT.Conclusion：Sanzi Yangqin decoction may regulate gene silencing，make protein isomerization，and affect transcription and translation through the signaling pathways of TNF-α，B cell receptor，TGF-β，and PI3K/AKT.

Keywords Microarray chip; Sanzi Yangqin Decoction; Allergic asthma; Molecular mechanism; Action pathway; Network pharmacology

中图分类号：R285文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.07.010

过敏性哮喘（Allergic Asthma，AA）是由一种慢性气道炎症，可引起反复发作的喘息、气促、胸闷和（或）咳嗽等症状，多在夜间和（或）凌晨发生，气道对多种刺激因子反应性增高。世界变态反应组织白皮书估计全球过敏性疾病的患病率为10%～40%，其中包括3亿支气管哮喘患者[1]。城市儿童哮喘流行病学调查结果显示：在确诊的哮喘患儿中50.1%伴有过敏性鼻炎[2]。目前，糖皮质激素仍然是治疗AA的首选[1]，但是这些治疗并不总是完全有效，而且有不良反应且容易产生耐药性。随着现代医学的进步，治疗方案一直在完善，但AA預后仍不理想，复发率高，反复呼吸道感染史、药物过敏、被动吸烟接触史是影响过敏性支气管哮喘发生主要危险因素[3]。因此，探索AA的发病机制和新治疗靶点具有重要意义。

随着微阵列芯片技术的进步和中医药现代化的发展，为寻找复杂疾病的潜在靶点和中医药中潜在治疗药物提供了更多的可能性[4]。三子养亲汤莱菔子、紫苏子、白芥子3味中药组成，具有温肺化痰，降气消食之功效。有Meta分析研究表明，三子养亲汤联合西药较仅使用西医治疗方法对哮患者有更好效果[5]。因此研究三子养亲汤治疗AA的机制，可能对进一步研究AA做出贡献。本研究通过数据挖掘结合生物信息学技术，比较AA患者与正常人的基因芯片数据库，通过对三子养亲汤有效成分与AA靶点的网络分析，以期进一步探索AA发病及治疗的有效途径。

1 资料与方法

1.1 分子和靶蛋白的收集与处理 在中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）中查询紫苏子、莱菔子、白芥子的成分，筛选条件口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%、类药性（Drug Likeness，DL）≥0.18;检索其作用靶点，在Uniprot网站中将蛋白名转化成基因名，得到3种中药的作用靶点。在GEO数据库中以“Allergic Asthma”为关键词进行检索芯片，下载与AA相关的GSE40889基因表达谱。GSE40889由Raedler D等提交，实验基于Affymetrix的GPL6244平台。GSE7307数据集包括114个样本集，取其中的45个AA患者样本和45个正常人样本。使用GCBI基因大数据分析工具对AA的基因芯片进行差异表达分析，分为过敏性哮喘组与正常对照组后，对2组样本的基因表达进行差异化分析，以P<0.001过滤，取差异表达最明显的213个基因，经筛选去重后，得到过敏性哮喘的疾病靶点。

1.2 网络构建与核心靶蛋白筛选 使用Cytoscape 3.2.1中BisoGenet插件，分别构建三子养亲汤成分作用靶点与过敏性哮喘的疾病靶点蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-protein Interaction，PPI） 网络，并通过Merged工具进行合并，对合并后的网络使用Network Analyser与CytoNCA工具进行拓扑属性分析，并以“度”和“介数”筛选核心靶点网络，得到中药-靶点-疾病核心网络，并绘制热图及火山图。根据“度”和“介数”值筛选核心基因，值越高表示基因在网络中越重要。

1.3 差异基因的富集分析 为了阐明三子养亲汤治疗过敏性哮喘差异基因的潜在生物过程（Biological Process，BP）、分子功能（Molecular Function，MF）和细胞组分（Cell Component，CC），利用DAVID6.8数据库将差异表达基因列表导入该数据库进行基因本体（Gene Ontology，GO）富集分析，从而得到基因的功能水平分析结果。京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）分析是一个整合了基因组、化学和系统功能信息的数据库。将三子养亲汤治疗过敏性哮喘的差异表达基因列表导入DAVID6.8数据库，利用数据库分析基因与生物通路的关系，从而阐明与三子养亲汤治疗过敏性哮喘相关的信号转导途径。以P<0.05为差异有统计学意义。

1.4 核心靶点的模块分析 使用Cytoscape 3.2.1的MCODE插件筛选核心靶点中的模块，根据所得模块的Score值对模块进行筛选，同时在David数据库中对模块进行GO注释富集分析与KEGG通路富集分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 靶点收集结果 共查询紫苏子、莱菔子、白芥子3种中药的有效成分21个，其中莱菔子有效成分2个，紫苏子有效成分14个，白芥子有效成分2个。见表1。中药对应靶点268个，其中莱菔子有效成分对应靶点11个，白芥子有效成分对应靶点19个，紫苏子有效成分对应靶点105个。见表2。根据GPL6244平台对AA差异基因进行比较可得上调基因172个，下调基因18个。见表3。

2.2 网络构建与核心蛋白筛选结果 核心PPI网络共有230个核心节点、6 919条相互关联的边。对该网络分析结果如热力图及火山图，热力图红色部分表示上调基因，绿色部分表示下调基因;火山图每个节点代表一个靶点，节点越高，代表该基因在此过程中越重要。结合对核心PPI的拓扑分析确定了10个重要的核心基因，即TP53、MCM2、EGFR、CDK2、FN1、UBC、NPM1、OBSL1、HSP90AB1、SIRT7。见图1～2。

2.3 差异基因的GO分析结果 差异基因在生物过程中显著富集，包括膜组织、对可卡因的反应、自噬调节、宿主对病毒转录的正调控、核苷酸切除修复;细胞组分主要富集在ESC/E（Z）复合体、转录因子复合物、局灶性粘连、细胞-细胞黏附连接细胞、线粒体、细胞质等;分子功能主要富集RNA结合、双链DNA结合、蛋白质结构域特异性结合等。见表4。

2.4 差异表达基因的KEGG分析 根据KEGG途径富集分析，差异基因主要富集在代谢途径、雌激素信号通路、PI3K-AKT信号通路等。见表5。

2.5 核心靶点的模块分析 Cytoscape 3.7.0分析出2个重要的模块。10个核心基因全被包含在该2个模块里，意味着这2个模块可能明显代表着该PPI的生物特征。因此这10个基因被定义为PPI网络中的主要节点。在GO富集分析方面，模块1主要集中在基因沉默的调控、蛋白质异构化、细胞-细胞黏附、病毒过程等方面。模块2主要富集在RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、p53介导的内源性凋亡信号通路对DNA損伤的响应、DNA模板、宿主对病毒转录的正调控等。在KEGG富集方面，模块1主要与DNA复制、核苷酸切除修复相关，模块2主要富集在细胞周期Notch信号通路、FoxO信号通路、PI3K-AKT信号通路等信号通路。见图3～4。

3 讨论

过敏性哮喘属中医“哮病”“喘病”范畴，发时治标，平时治本，故本研究中AA限定为发作期哮病。本研究通过检索莱菔子、紫苏子、白芥子3味中药，共找到21各有效成分，268各对应靶点，体现了中医药发挥作用的复杂性，与中医异病同治、同病异治的理论相吻合。现代药理研究发现三子养亲汤具有抗炎、止咳、平喘的药理作用，临床上常用于治疗支气管哮喘，作用效果与地塞米松相同[6-7]。方中白芥子辛温燥烈，善温化寒痰，利气散结;紫苏子辛温芳香，善降气消痰，止咳平喘，并有润肠通便之功，有利于肠中痰浊下降而利肺气;莱菔子消食导滞，降气祛痰。亦有学者将三子养亲汤方研磨进行三伏贴治疗儿童哮喘[8]。

PPI网络的复杂也说明了三子养亲汤治疗过敏性哮喘的机制复杂，不同剂量的配伍可能存在不同的主要通路机制。有研究表明，三子养亲汤能够发挥抗支气管哮喘的作用，并显著降低哮喘大鼠支气管肺泡灌洗液（Bronchoalveolar Lavage Fluid，BALF）中白细胞介素（Interleukin，IL）-5表达量[9]，其机制可能与调控Th1/Th2平衡失调有关，其作用效果与孟鲁司特钠相当[10]。对三子养亲汤的化学成分的分析研究证实[11-12]，三子养亲汤水煎剂中的脂肪油成分占比最大，具有镇咳、祛痰、平喘作用，同时可促进胸腺进一步产生淋巴细胞，可能是三子养亲汤发挥作用的关键。结合网络分析，来源于莱菔子及紫苏子的谷甾醇等小分子成分可能是三子养亲汤治疗AA的主要化学成分。有实验证明，β-谷甾醇可提高抗炎因子IL-10的活性，减小趋化因子和炎症介质活性[13]，同时抑制核因子κB迁移，其作用机制是通过减少一氧化氮的合成，抑制巨噬细胞IL-6活性，炎症介质的分泌，实现抗炎作用[14]。分析结果中，来源于紫苏子的有效化合物最多，说明紫苏子是三子养亲汤治疗过敏性哮喘中最重要的物质来源。有研究单用苏子水提取物与糖皮质激素、β受体激动剂、茶碱类药物比较，发现紫苏水体无对于哮喘的疗效要明显好于对照组[15]。有研究显示，紫苏子提取物苏子油可显著减少小鼠支气管肺泡灌洗液中IL-1β和IL-6等炎症介质的产生，但其对Th1/Th2的平衡无明显作用[16]。

差异基因的高表达或者低表达是过敏性哮喘发病的关键点，同时也是三子养亲汤治疗AA的切入点。从分析结果来看，结合现有资料，三子养亲汤可能通过TNF-α、B细胞受体、TGF-β、PI3K/AKT等信号通路[17-18]，对细胞膜组织及细胞的转录翻译过程产生影响，进而影响蛋白质的合成，降低炎症介质释放，进而达到降低气道高反应以及抗炎的作用[19];同时，三子养亲汤可降低炎性细胞的黏附连接、影响RNA与DNA过程，从而与蛋白质结构域特异性结合，激活自身免疫系统来降低气道高反应[11]。从富集结果来看，宿主对变应原的免疫反应是三子养亲汤治疗过敏性哮喘的关键步骤，主要体现在激活人体本身免疫系统方面，自噬作用以及病毒转录调控、核苷酸切除等调节细胞、病毒的生命过程方面。对核心基因的模块分析标明，三子养亲汤可引起基因沉默、影响病原体的繁殖，并且使病原体的蛋白质异构、降低病原体的黏附能力，从而降低炎症反应。对模块的KEGG通路富集结果与核心网络的富集结果相同，进一步证明了结果的可靠性，证明核心基因可涵盖整个组方的作用特点。

综上所述，本研究通过挖掘高通量GEO基因芯片数据库并借助DAVID和string等在线分析工具，挖掘并分析了过敏性哮喘患者与正常人之间的差异基因，并在分析软件中将三子养亲汤的有效成分及其作用靶点与差异基因虚结合，分析结果提示三子养亲汤主要通过TNF-α、B细胞受体、TGF-β等信号通路参与对细胞膜组织及细胞的转录翻译过程产生影响，进而影响蛋白质的合成，降低炎症介质释放，进而达到抗炎的作用。这些研究结果将为过敏性哮喘的分子靶向治疗提供一些指导意义，同时也迫切需要新的实验研究来验证本实验结果，为治疗过敏性哮喘做出更进一步的贡献。

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（2020-07-05收稿 本文编辑：王明）