二氧化硅对人肺腺癌A549 细胞的毒性作用

张映驰， 吴梦宇， 李 洁， 单 婧， 史新琛， 徐海明

（1.宁夏医科大学公共卫生与管理学院，银川 750004； 2.宁夏回族自治区环境因素与慢性病控制重点实验室，银川 750004）

矽肺是尘肺中进展最快、危害最严重的一种法定职业病，是我国职业病防治的重点及难点。该病是由长期吸入含有游离二氧化硅的粉尘引起，其病理特征为肺组织弥漫性纤维化和矽结节形成[1]。二氧化硅暴露可以导致职业人群及实验动物体内氧化应激失衡及炎性反应[2-4]。本课题组前期研究[5]表明，非神经元型胆碱能系统（nonneuronal cholinergic system，NNCS）关键分子乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase，AChE）在矽肺患者外周血血清中显著降低。另有研究[6]表明，NNCS系统与上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）存在较为密切的关联。本研究以源于Ⅱ型肺泡上皮细胞的人源A549 细胞为体外细胞模型，观察二氧化硅暴露对该细胞内氧化应激指标、炎性细胞因子及NNCS 关键分子AChE酶活性和乙酰胆碱受体（CHRM5、CHRNA7 和CHRNA9）mRNA 表达水平的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞培养与分组

在DMEM 基础培养基中加入一定体积分数的胎牛血清（10%）及青链霉素（1%），将其作为A549 细胞的培养基。细胞于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。使用含0.01% EDTA 的胰蛋白酶（浓度为0.125%）进行消化传代操作，传代频率为2～3 d/次。设置空白组（不接种细胞，只加相应体积的完全培养基）、对照组（二氧化硅0 μg·cm-2）及二氧化硅暴露组（1、2、4、8 μg·cm-2），暴露时长为24 h。

1.2 二氧化硅

二氧化硅购自美国Sigma 公司（CAS：12173-28-3，孔径：6～11 nm，SSA：550～600 m2·g-1）。将二氧化硅加入完全培养基中，配制成浓度为50 mg·L-1的二氧化硅储备液，暴露实验前进行相应的稀释操作。

1.3 细胞上清液及裂解液收集

根据预实验结果，将细胞悬液密度调整为8.0×104个/mL，接种于96 孔板中，接种体积为100 μL/孔。暴露结束后，在所有的微孔中各加入10 μL 的CCK-8 反应液。随后，将微孔板转移至CO2培养箱中孵育1 h。孵育结束后，使用多功能全波长酶标仪测定各孔的光密度值（OD），测定波长为450 nm，使用校正吸光度值（为扣除空白孔OD 值之后的吸光度值）进行计算。

随后，将细胞悬液密度调整为2×105个/mL，接种于6 孔板中，接种体积为2 mL/孔。暴露结束后，将细胞上清液收集至离心管中，用于测定炎性细胞因子肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）及白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）的水平。随后，加入PBS 洗去多余的培养基，重复3 次，使用细胞刮刀刮取细胞，将细胞转移至离心管中。制备细胞裂解液，用于测定氧化应激指标超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）及丙二醛（malondialdehyde，MDA）的水平。需要注意的是，收集细胞上清液及裂解液过程中使用到的所有实验材料及试剂均需提前置于冰上预冷，以保证获得可靠的实验结果。

1.4 生化指标测定

使用化学比色法测定SOD（南京建成生物科技有限公司）及MDA（南京建成生物科技有限公司）水平；使用酶联免疫吸附方法测定TNF-α 及IL-6 水平（武汉伊莱瑞特有限公司）；通过改良Ellman 方法测定AChE 酶活性；使用考马斯亮蓝染色法测定细胞上清液及裂解液中的总蛋白。正式测定前，根据预实验结果确定合理的稀释倍数，以保证测定结果处于试剂盒的线性测定范围之内。

1.5 基因表达水平的测定

参照分子克隆指南及试剂盒说明书，进行样品中总RNA 提取、逆转录及实时荧光定量PCR操作（引物序列见表1），使用2-△△CT法分析处理实验数据。

表1 基因扩增引物序列

1.6 统计学方法

采用SPSS 22.0 统计学软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用LSD-t法。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 二氧化硅暴露对A549 细胞活性的影响

与对照组相比，1、2、4、8 μg·cm-2二氧化硅刺激细胞24 h 后，对细胞活性均无影响（P 均＞0.05），见表2。因此，在后续的暴露实验中，选择上述剂量作为暴露剂量，进一步研究二氧化硅所致的毒性效应。

表2 二氧化硅刺激人肺腺癌A549 细胞24 h 后对细胞活性的影响（±s）

表2 二氧化硅刺激人肺腺癌A549 细胞24 h 后对细胞活性的影响（±s）

二氧化硅浓度/（μg·cm-2） n 细胞活性/%0 6 100.00±3.77 1 6 99.27±3.32 2 6 101.43±2.48 4 6 97.96±4.30 8 6 95.23±3.88

2.2 二氧化硅暴露对A549 细胞中氧化应激指标及炎性细胞因子水平的影响

与对照组相比，4、8 μg·cm-2暴露组细胞裂解液中SOD 活性下降（P 均＜0.05），8 μg·cm-2二氧化硅暴露组细胞上清液中TNF-α 含量升高了9.8%（P＜0.05）；4、8 μg·cm-2二氧化硅暴露组细胞上清液中IL-6 含量分别升高了18.1%和37.7%（P 均＜0.05），见表3。

表3 二氧化硅刺激A549 细胞24 h 后对氧化应激指标及炎性细胞因子水平的影响（±s）

表3 二氧化硅刺激A549 细胞24 h 后对氧化应激指标及炎性细胞因子水平的影响（±s）

与对照组比较*P＜0.05。

二氧化硅浓度/（μg·cm-2） n SOD/（U·mgprot-1） MDA/（pmol·mgprot-1） TNF-α /（ng·L-1） IL-6/（ng·L-1）0 3 41.76±1.28 80.20±4.07 798.66±30.81 42.88±0.31 1 3 37.46±2.95 81.43±2.44 779.33±26.43 45.13±1.96 2 3 37.11±2.57 79.38±4.56 821.09±8.48 45.27±2.91 4 3 20.96±2.01* 83.27±1.27 807.17±21.90 50.62±2.10*8 3 20.11±3.92* 85.66±2.06 877.29±10.83* 59.04±4.58*

2.3 二氧化硅暴露对A549 细胞内AChE 酶活性的影响

与对照组相比，1、2、4 μg·cm-2二氧化硅暴露剂量下细胞裂解液中AChE 酶活性无变化（P均>0.05）。随着暴露剂量的进一步升高，8 μg·cm-2暴露组细胞裂解液中AChE 酶活性较对照组降低了40.7%（P＜0.05），见表4。

表4 二氧化硅刺激A549 细胞24 h 后对AChE活性的影响（±s）

表4 二氧化硅刺激A549 细胞24 h 后对AChE活性的影响（±s）

与对照组比较*P<0.05。

二氧化硅浓度/（μg·cm-2） n AChE 活性（U/104cell）0 3 17.65±1.02 1 3 17.43±0.97 2 3 17.49±0.78 4 3 16.23±1.35 8 3 10.47±0.41*

2.4 二氧化硅暴露对A549 细胞内乙酰胆碱受体mRNA 的表达水平的影响

与对照组相比，4、8 μg·cm-2二氧化硅暴露组CHRM5 及CHRNA7 mRNA 表达水平均降低，8 μg·cm-2暴露剂量下CHRNA9 mRNA 表达水平升高（P 均＜0.05），见表5。

表5 二氧化硅刺激A549 细胞24 h 后对乙酰胆碱受体mRNA 表达量的影响（±s）

表5 二氧化硅刺激A549 细胞24 h 后对乙酰胆碱受体mRNA 表达量的影响（±s）

与对照组比较*P<0.05。

二氧化硅浓度/（μg·cm-2） n CHRM5 CHRNA7 CHRNA9 0 3 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 1 3 0.96±0.22 1.06±0.04 1.20±0.13 2 3 1.37±0.29 1.03±0.09 1.15±0.28 4 3 0.61±0.12* 0.71±0.12* 1.24±0.15 8 3 0.55±0.27* 0.32±0.09* 2.44±0.24*

3 讨论

机体氧化-抗氧化平衡对维持正常的生物学功能起着重要作用，外源刺激会打破该平衡，导致体内ROS 的过量蓄积并诱发多种疾病的发生。SOD 是生物体系中抗氧化酶系的重要组成成员，其含量随着接触粉尘的增多以及时间的延长而逐渐消耗。MDA 含量是反映生物有机体抗氧化潜在能力的重要参数，可以反映机体脂质过氧化速率和强度，也能间接反映组织过氧化损伤程度[7-9]。在本研究中，二氧化硅刺激A549 细胞后，SOD 水平下降，MDA 含量未发生变化，提示二氧化硅暴露从一定程度上影响了A549 细胞内的氧化-抗氧化平衡。

TNF-α 是一种涉及系统性炎症的细胞因子，同时也是属于引起炎性反应的众多细胞因子中的一员。TNF-α 由1 型辅助性T 细胞（Th1）分泌，可以诱导炎性细胞的吸附，促进炎症的发生和成纤维细胞增殖[10]。IL-6 是一种功能广泛的多效性细胞因子，在尘肺的发生发展中发挥抗炎、促炎、致纤维化等多种作用[11]。在本研究中，二氧化硅刺激A549 细胞后，上清液中TNF-α 和IL-6 水平均出现不同程度的升高，提示外源性二氧化硅可以诱导A549 细胞的炎性反应。

NNCS 系统包括AChE、胆碱乙酰转移酶（ChAT）、胆碱酯酶（ChE）、毒蕈碱型乙酰胆碱能受体（mAChR）和烟碱胆碱能受体（nAChR），在生物体内广泛存在。一方面，该系统参与调节有机体的正常生理功能。另一方面，还与一些疾病的病理变化相关[12-13]。有研究[14-15]表明，乙酰胆碱受体激动剂卡巴胆碱作用于A549 细胞可以促进EMT 过程。在本研究中，二氧化硅暴露可引起A549 细胞中AChE 酶活性下降，同时影响乙酰胆碱受体CHRM5、CHRNA7 和CHRNA9 的mRNA表达水平。上述结果提示，二氧化硅暴露可能通过影响NNCS 关键分子AChE 及乙酰胆碱受体的水平，进而影响A549 细胞的EMT 过程。

综上所述，二氧化硅暴露可以影响人肺腺癌A549 细胞内的氧化应激平衡及炎性细胞因子的表达水平，同时影响与EMT 密切相关的NNCS关键分子AChE 酶活性及乙酰胆碱受体mRNA的表达水平。本研究结果为深入理解二氧化硅所致的毒性效应及机制提供了一个新的视角。