SGLT2i 对肾病综合征模型大鼠骨代谢的影响

洪文娟，邹久林，余卓锐，成家茂，何敏华*

（1.大理大学临床医学院，云南大理 671000；2.大理大学第一附属医院，云南大理 671000；3.大理大学基础医学院，云南大理 671000）

钠-葡萄糖协同转运蛋白2 抑制剂（sodium glucose cotransporter 2 inhibitor，SGLT2i）是一种新型口服降糖药物，通过抑制近曲小管中葡萄糖共转运体的活性，诱导糖尿、渗透性利尿，并降低葡萄糖的再吸收〔1〕。最近研究发现，SGLT2i 不仅可以降血糖，还有降低血肌酐、减少蛋白尿以及由肾脏疾病引起死亡的作用〔2-3〕。随着SGLT2i 在肾脏病领域的临床应用越来越广泛，其不良反应也日益受到重视。研究表明SGLT2i 卡格列净可以提高骨转移率，降低髋部的骨矿物质密度，并增加骨折风险〔4〕。糖皮 质 激 素（glucocorticoid，GC） 是 肾 病 综 合 征（nephrotic syndrome，NS）的首选用药，但包括NS在内的慢性肾脏病可引起钙磷代谢紊乱，使用GC会加重钙磷代谢异常，甚至引起骨质疏松。目前，不同剂量SGLT2i 对钙磷代谢的影响以及SGLT2i 联用GC 是否加重骨质疏松等问题尚无定论。本研究旨在考察不同剂量卡格列净及联用GC 对阿霉素肾病（adriamycin nephropathy，AN）大鼠的治疗效果以及对大鼠骨代谢的影响，为NS 的临床用药提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要药物卡格列净片（西安杨森制药有限公司，批号：H20170375）；阿霉素（深圳万乐药业有限公司，批号：H44024359）；泼尼松片（华中药业股份有限公司，批号：H42021526）。

1.2 实验动物造模及分组SPF 级雄性SD 大鼠42 只，8 周，体质量250～300 g，购自成都达硕实验动物有限公司，许可证号：SCXK（川）2020-030。饲养在大理大学基础医学院动物实验室，自由摄食水。随机选取6 只为对照（NG）组，其余36 只大鼠经尾静脉一次性注射阿霉素6 mg/kg，建立AN 大鼠模型〔5〕，NG 组注射等量0.9%氯化钠溶液。7 d 后取大鼠眼内眦静脉血，造模大鼠出现低蛋白血症（白蛋白ALB（18.34±1.65）g/L）、高脂血症（甘油三酯（2.86±0.29）mmol/L，胆固醇（4.02±0.55）mmol/L）；检测24 h 尿蛋白定量（24 h-UTP），大于100 mg 表示造模成功〔6〕。造模大鼠随机分为6 组，每组6 只：模型（MG）组、泼尼松（PG）组、低剂量卡格列净（LCG）组、高剂量卡格列净（HCG）组、低剂量卡格列净+泼尼松（LPCG） 组和高剂量卡格列净+泼尼松（HPCG）组。

1.3 药物干扰按常规用药剂量：低剂量卡格列净100 mg/d，高剂量卡格列净300 mg/d，泼尼松1 mg/（kg·d），依据人与大鼠用药量换算方法，PG 组予泼尼松6.3 mg/kg，LCG 组予卡格列净10.5 mg/kg，HCG 组予卡格列净31.5 mg/kg，LPCG 组予泼尼松6.3 mg/kg+卡格列净10.5 mg/kg，HPCG 组予泼尼松6.3 mg/kg+卡格列净31.5 mg/kg。药片捣碎后，每天按大鼠空腹体质量计算药物剂量，用0.9%氯化钠溶液配制成溶液，NG、MG 组予等量0.9%氯化钠溶液，每天清晨8 时空腹灌胃，灌胃量1 mL/100 g，疗程6 周。

1.4 一般情况观察每天灌胃前观察记录大鼠的一般情况，包括精神、活动、进食、饮水、体毛、大小便、体质量等。

1.5 尿液指标检测治疗结束，将大鼠单独放置于代谢笼，禁食不禁水，用清洁干燥的容器收集每只大鼠24 h 尿液并记录总尿量。尿液标本立即送大理大学第一附属医院检验科，用全自动生化分析仪（7000120+ISE+ID 型）检测24 h-UTP、尿钙、尿磷。

1.6 骨密度及相关指标检测药物治疗6 周后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，采用仰卧位固定，送放射科用双能X 射线骨密度仪（SIEMENS YS10 Max）检测在体全身及区域骨密度、全身骨盐量、全身脂肪量、全身肌肉量。

1.7 血液指标检测骨密度检测后，全部大鼠在第2 天清晨空腹状态下，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，开腹后下腔静脉取血4 mL，3 000 r/min 离心10 min，提取上清液，检测血钙、血磷、ALB、碱性磷酸酶（ALP）。

1.8 统计分析用SPSS 20.0 软件进行统计分析，计量资料以（±s）表示。方差齐者采用方差分析并进行两两比较；方差不齐者，采用秩和检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 实验结果

2.1 各组大鼠尿液指标的比较灌胃治疗6 周后检测尿液指标并进行比较。与NG 组比较，MG 组的24 h-UTP 水平明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01）；与MG 组比较，各用药组24 h-UTP 水平均显著下降，差异有统计学意义（P＜0.01）；各用药组间比较差异均无统计学意义，说明各种药物治疗对降低24 h-UTP 水平均有效，2 种药联用与单独使用相比，24 h-UTP 水平略有下降，但差异无统计学意义。与NG 组比较，各组尿钙水平均有所上升，其中HCG、LPCG、HPCG 组尿钙水平明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与MG 组比较，LPCG、HPCG 组尿钙水平升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与PG组比较，HPCG 组尿钙水平升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。结果表明高剂量卡格列净或卡格列净与泼尼松联用可能会导致尿钙排泄增加。与NG 组比较，MG组尿磷水平明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01）；其余各组尿磷水平虽有所升高，但差异无统计学意义。结果显示NS 本身可导致尿磷排泄增加，而卡格列净或泼尼松对尿磷排泄影响不明显。见表1。

表1 6 周后各组大鼠尿液相关指标的比较（±s，n=6）

表1 6 周后各组大鼠尿液相关指标的比较（±s，n=6）

注：与NG 组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与MG 组比较△P＜0.05，△△P＜0.01；与PG 组比较#P＜0.05。

组别 24 h-UTP/mg 尿钙/（mmol/L） 尿磷/（mmol/L）NG 组 9.33±2.67 1.47±0.46 15.97±2.43 MG 组 319.46±41.26** 2.52±1.91 43.20±2.88**PG 组 69.79±36.52△△ 2.78±1.15 37.80±9.14 LCG 组 38.07±24.56△△ 3.51±1.17 36.98±2.59 HCG 组 42.14±30.18△△ 4.60±1.84* 37.08±12.94 LPCG 组 32.51±32.62△△ 5.16±3.18**△ 38.92±7.36 HPCG 组 33.17±36.97△△ 5.77±3.11**△# 33.77±8.21 F 41.127 3.697 20.862 P 0.000 0.006 0.002

2.2 各组大鼠血液生化指标的比较灌胃治疗6周后检测血液指标并进行比较。与NG 组比较，MG组的ALB 水平明显下降，差异有统计学意义（P＜0.01）；与MG 组比较，PG、LCG、HCG、LPCG、HPCG组的ALB 水平升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。说明各种药物治疗后均可有效升高血清ALB 水平。与NG 组比较，除MG 组外，其余各组血钙水平均有所升高，但差异无统计学差异。与NG 组比较，PG、HCG 组的血磷水平升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与MG 组比较，PG 组的血磷水平升高，差异有统计学意义（P＜0.01）；与PG 组比较，LCG、HCG、LPCG、HPCG 组的血磷水平下降，其中LCG、LPCG组与PG 组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。结果表明与正常组比较，泼尼松、高剂量卡格列净可导致血磷水平明显升高。各用药组ALP 水平均升高，其中NG 组与MG、PG、HCG、HPCG 组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；与MG 组比较，其余各组ALP水平均下降，其中LCG 组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。实验结果表明，疾病本身、泼尼松、高剂量卡格列净或上述2 种药联用可导致ALP 水平明显升高，均可能与骨质疏松相关。见表2。

表2 6 周后各组大鼠血液相关指标的比较（±s，n=6）

表2 6 周后各组大鼠血液相关指标的比较（±s，n=6）

注：与NG 组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与MG 组比较△P＜0.05，△△P＜0.01；与PG 组比较#P＜0.05，##P＜0.01。

组别 血磷/（mmol/L） ALP/（mmol/L）NG 组 1.67±0.47 120.38±51.85 MG 组 1.78±0.09 251.70±65.67**PG 组 2.27±0.37**△△ 209.41±88.20*LCG 组 1.84±0.19# 165.63±37.59△HCG 组 2.05±0.20* 213.79±65.08*LPCG 组 1.77±0.10## 190.81±29.99 HPCG 组 1.96±0.23 214.89±49.22*F 2.855 2.608 P 0.027 0.039 ALB/（g/L）26.52±3.62 16.75±1.46**21.60±2.87△△21.55±1.38△20.74±1.58△△23.20±1.19△△22.85±2.01△5.027 0.001血钙/（mmol/L）2.05±0.22 2.01±0.07 2.35±0.09 2.19±0.10 2.27±0.23 2.24±0.01 2.28±0.11 2.243 0.068

2.3 大鼠骨密度及相关指标的比较

2.3.1 在体全身骨密度及相关指标各组大鼠在体全身骨密度、肌肉及脂肪量经统计分析，差异均无统计学意义。与NG 组相比，PG、HPCG组全身骨盐量下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；与MG 组比较，PG 组全身骨盐量下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。结果表明与正常组比较，泼尼松或泼尼松与高剂量卡格列净联用，可导致全身骨盐量下降，是骨质疏松的相关因素之一。见表3。

表3 6 周后各组大鼠全身骨密度及相关指标的比较（±s，n=6）

表3 6 周后各组大鼠全身骨密度及相关指标的比较（±s，n=6）

注：与NG 组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与MG 组比较△P＜0.05。

组别 全身肌肉量/g 全身脂肪量/g NG 组 694.00±36.15 260.00±76.68 MG 组 644.00±115.02 220.50±72.85 PG 组 580.50±153.91 224.50±62.99 LCG 组 620.00±148.98 241.00±67.92 HCG 组 645.17±171.43 234.00±58.16 LPCG 组 604.00±109.54 234.00±71.20 HPCG 组 590.00±131.55 255.67±70.25 F 4.001 0.279 P 0.677 0.943全身骨密度/（g/cm2）0.20±0.06 0.16±0.03 0.13±0.02 0.18±0.06 0.17±0.06 0.15±0.03 0.16±0.05 10.119 0.120全身骨盐量/g 19.35±1.37 16.90±0.11 11.85±0.27**△16.55±2.25 17.05±4.16 15.03±1.53 13.40±0.22*27.763 0.000

2.3.2 在体区域骨密度大鼠头、上肢、大腿、脊柱的在体区域骨密度经统计分析，差异均无统计学意义。与NG 组比较，PG、HPCG 组的躯干、肋骨骨密度数值下降，差异有统计学意义（P＜0.05），PG、LCG、HCG、LPCG、HPCG 组的骨盆骨密度数值均下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；与MG 组比较，PG、HPCG 组肋骨骨密度数值下降，差异有统计学意义（P＜0.01）。结果显示，造模未引起在体区域骨密度明显变化，与正常组比较。泼尼松和卡格列净会引起区域骨密度下降，其中以骨盆骨密度下降最为明显；而泼尼松或泼尼松与高剂量卡格列净联用，可导致躯干、肋骨骨密度下降，增加了骨质疏松及骨折的风险。见表4。

表4 6 周后各组大鼠在体区域骨密度的比较（±s，n=6）

表4 6 周后各组大鼠在体区域骨密度的比较（±s，n=6）

注：与NG 组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与MG 组比较△△P＜0.01。

骨密度/（g/cm2）组别 脊柱NG 组 0.15±0.01 MG 组 0.17±0.06 PG 组 0.12±0.02 LCG 组 0.15±0.03 HCG 组 0.14±0.02 LPCG 组 0.12±0.03头0.38±0.21 0.34±0.00 0.20±0.06 0.57±0.43 0.39±0.24 0.28±0.13上肢0.51±0.47 0.49±0.12 0.11±0.05 0.26±0.20 0.34±0.22 0.11±0.03大腿0.14±0.01 0.13±0.02 0.12±0.02 0.12±0.02 0.13±0.03 0.13±0.01躯干0.13±0.00 0.12±0.01 0.10±0.01*0.11±0.00 0.11±0.01 0.12±0.01肋骨 骨盆0.11±0.00 0.13±0.00 0.12±0.01 0.12±0.01 0.08±0.00*△△ 0.10±0.01*0.09±0.01 0.10±0.00**0.10±0.03 0.11±0.00*0.11±0.01 0.10±0.02*HPCG 组 0.17±0.04 0.60±0.43 0.12±0.01 F 0.44±0.19 0.10±0.02* 0.08±0.00*△△ 0.11±0.00*8.192 11.904 11.353 22.690 22.944 20.350 11.600 P 0.224 0.064 0.078 0.001 0.001 0.002 0.072

3 讨论

越来越多的研究发现，SGLT2i 除降血糖之外有独立的肾脏保护作用。在SGLT2i 治疗包括NS 在内的慢性肾病过程中，主要作用体现在降低尿蛋白，其机制是通过对钠-葡萄糖协同转运蛋白2 的抑制，阻断了近端小管对Na+的摄取，导致输送至致密斑的Na+增加，刺激转化生长因子介导的管球反馈，引起入球小动脉收缩，从而降低肾小球内高血压〔1，7-8〕。GC 作为NS 的治疗基石，同时是导致骨质疏松和骨折的一个危险因素，临床指南建议在开始GC 治疗时应考虑使用抗骨质疏松药物进行预防性治疗〔9〕。同时SGLT2i 的副作用也不容小觑，如酮症酸中毒、泌尿生殖系统感染、骨折、下肢截肢风险和肿瘤等〔10〕。研究认为，SGLT2i 可影响肾小管对钙、磷酸盐的吸收和排泄，对骨代谢产生一定影响。在临床试验中，与使用安慰剂相比，SGLT2i 引起的下肢截肢风险增加了大约2 倍〔11〕，可能机制或影响因素包括血清磷酸盐升高、维生素D 水平降低、体质量减少、相对高剂量、低血压、糖尿病并发症等。但Perkovic 等研究表明，卡格列净与安慰剂组在下肢截肢风险方面没有显著性差异〔12〕。因此，SGLT2i 的不良事件仍需大样本、多中心的临床实验和相关基础实验进一步予以验证。

本实验通过对阿霉素诱导的AN 大鼠模型给予泼尼松、不同剂量卡格列净或两者联合用药，结果发现2 种药物均可有效降低尿蛋白、升高ALB，可用于NS 的治疗，但治疗过程中均会引起骨盆骨密度的下降。其中泼尼松、高剂量卡格列净或二者联用还会引起钙磷代谢异常、ALP 升高、全身骨盐量降低及骨密度下降范围扩大，增加了骨质疏松的风险。目前GC 对骨损伤的作用机制已被充分认识，但SGLT2i 作为一种新型降糖药，其副作用易被忽视。结合本实验结果分析，卡格列净影响肾小管对钙、磷酸盐的吸收和排泄，可能打破了成骨细胞和破骨细胞的平衡，使血清ALP 水平增高，骨代谢增加，并表现为骨盐量减少和骨密度降低。因此，本研究认为SGLT2i 是导致骨质疏松的一个危险因素，且与用药剂量呈正相关，但其用药时间以及联合用药对骨代谢的影响仍需要更多的实验予以证实。尽管SGLT2i 致骨折的风险仍有待明确，但在骨质疏松、骨折高风险人群中仍应谨慎使用。NS 患者在使用卡格列净、泼尼松或二者联合治疗时，建议早期即积极使用抗骨质疏松药物进行预防性治疗，并定期复查血钙、血磷、ALP、骨密度、甲状旁腺激素等骨代谢相关指标，积极防治骨质疏松。