6种杀菌剂对烟草青枯病菌的室内防治效果

陆铮铮

（遵义师范学院，贵州遵义563002）

贵州是烟草种植的主产区，烤烟是遵义地区农村的重要经济作物，是农民脱贫致富、乡村振兴的重要渠道。烟草青枯病是由青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanaceanm）侵染引起的细菌性土传病害，是烟草生产种植中的一大毁灭性病害［1］。该病害在贵州广泛发生和流行，且防治较难，其对烟草种植面积较大的遵义地区影响颇大，减缓了遵义地区烟草叶的发展。

目前防治该病害仍以化学防治为主，市面上防治细菌性病害的药剂琳琅满目。近年来，在寻求绿色、安全的防治方法中，利用微生物源制剂防治植物病害中取得了一定的成效［2］，且市面上微生物农药的选择也逐渐增多。为能更好地在室内筛选出对烟草青枯病菌具有抑制作用的药剂，探索出操作简单、方便、效果显著的细菌性病害防治方法及药剂，选取常用的3种化学农药（中生·四霉素、中生菌素和春雷·中生）和3 种微生物农药（木霉菌、枯草芽孢杆菌和哈茨木霉菌）杀菌剂，考察划线+纸碟法、划线+打孔法、喷雾+纸碟法、喷雾+打孔法4种室内对峙试验方法的测定效果，并选取最优方法考察6种杀菌剂对烟草青枯病菌的室内防治效果，以期为田间试验测定以及示范推广提供重要基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 采集遵义市务川县茅天镇红星村烟草种植区中烟草青枯病植株，带回实验室采用平板划线分离法分离、纯化。采用柯赫氏法则获得烟草青枯病病原菌之后，采用斜面保存方法进行保存备用。

1.1.2 供试药剂 化学药剂：1 号为中生·四霉素（海利尔药业集团股份有限公司），推荐剂量50 mL/667m2；3 号为春雷·中生（福建凯立生物制品有限公司），推荐剂量为160 g/667m2；5 号为3%中生菌素可湿性粉剂（江西正邦作物保护有限公司），推荐剂量为40 g/667m2。微生物药剂：2 号为2 亿孢子/g 木霉菌可湿性粉剂（上海万力华生物科技有限公司），推荐剂量为200 g/667m2；4 号为1 000 亿芽孢/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂（武汉科诺生物科技股份有限公司），推荐剂量为120 g/667m2；6号为3亿cfu/g 哈茨木霉菌可湿性粉剂（美国拜沃股份有限公司），推荐剂量为120 g/667m2。

1.1.3 培养基 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（NA）：牛肉膏3～5 g、10 g 蛋白胨、5 g NaCl、20～25 g 琼脂、1 000 mL 蒸馏水、pH 7.0～7.2［3］。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分离 将采回的病株用清水冲洗，取发病部位一小块组织在显微镜下观察有无喷菌现象，观察到喷菌现象后，采用平板划线分离法分离。采用柯赫氏法则，将分离出的细菌接种于组织培养中的烟苗中，待发病之后，观察、分离、纯化获得病原菌（浓度为3×108cfu/mL）。

平板划线分离法［3］：取一小块病组织，经表面消毒后用无菌水洗3次，置于灭菌载玻片上的无菌水中，用灭菌解剖刀切碎。静置60 s后，用灭菌的接种环蘸取组织液在NA 平板上划线培养。置于32℃恒温培养箱培养3 d 后，挑取单个菌落进行纯化培养。

1.2.2 药剂配制 对峙试验采用直径为75 mm 的培养皿，则培养皿的面积=3.14×（0.037 5 m）2=0.004 4 m2，即为青枯病菌可生长的面积。

试验设置3个浓度，分别是依据各药剂推荐的浓度作为中间浓度，扩大10 倍和缩小10倍。配制浓度为各药剂推荐剂量100 倍的母液，量取10 mL 置于90 mL 的无菌水中，混合、溶解均匀，标记为最大浓度，然后从最大浓度中取1 mL 药液置于9 mL 的无菌水中混合均匀，标记为中间

浓度，然后从中间浓度中取1 mL 的药液放入9 mL 的无菌水中混合均匀，标记为最小浓度。3个浓度的药液配置完毕，待用。

1.2.3 对峙培养测定

1）划线+纸碟法（方法1）：将待测的青枯病菌均匀的在NA 培养基上进行划线，然后将直径为7 mm 的无菌中性滤纸碟浸泡在每一梯度浓度的药剂液中15 s，然后用灭菌镊子取出滤纸碟，将剩余的药液沥干，然后将吸附了药液的3 张滤纸碟重叠放入已经划线接种的青枯菌的培养基中央，轻轻按压使其服帖在培养基上，每个浓度3 次重复，将无菌水浸泡的滤纸碟作为对照。做好标记，放入32℃的恒温培养箱中培养30 min 后将培养基倒扣继续培养72 h后观察、测量。

2）划线+打孔法（方法2）：将待测的青枯病菌均匀的在NA 培养基上进行划线，然后用直径为7 mm 的打孔器在培养基中央打孔，将打孔后的培养基取出，使培养基中央形成一个洞穴，然后用移液枪吸取相应的药剂30 μL注入到洞穴中，每个浓度3 次重复，将洞穴注入无菌水作为对照。做好标记，放入32℃的恒温培养箱中培养72 h后观察、测量。

3）喷雾+纸碟法（方法3）：将直径为7 mm 的无菌中性滤纸碟浸泡在每一梯度浓度的药剂液中15 s，然后用灭菌镊子取出滤纸碟，将剩余的药液沥干，然后将吸附药液的3 张滤纸碟重叠放入NA 培养基中央，轻轻按压使其服帖在培养基上。然后用无菌喉头喷雾器将浓度为3×108cfu/mL 的烟草青枯菌悬液喷入放有滤纸碟的NA 培养基上，每个浓度3 次重复，将无菌水浸泡的滤纸碟作为对照。做好标记，静置30 min后，将平板倒扣置于30℃恒温培养箱培养，72 h后观察、测量。

4）喷雾+打孔法（方法4）：用直径为7 mm 的打孔器在培养基中央打孔，将打孔后的培养基取出，使培养基中央形成一个洞穴，用移液枪吸取相应的药剂注入到洞穴中，然后用无菌喉头喷雾器将浓度为3×108cfu/mL 的烟草青枯菌悬液喷入NA 培养基上，每个浓度3 次重复，将洞穴注入无菌水作为对照。做好标记，放入32℃恒温培养箱中培养72 h后观察、测量。

在初步探究4 种对峙培养方法后发现纸碟法效果最佳，在重复第2 次试验中采用划线+纸碟法考察6 种药剂对青枯病菌的室内防治效果。

1.2.4 抑菌圈观察、测量及计算公式 对峙培养的培养基置于32℃的恒温培养箱中培养72 h 后，取出。观察抑菌圈的形态（包括抑菌圈的透明度、边缘清晰度和界限明显度）。以及测量抑菌圈直径的大小（以mm为单位），计算其平均值。计算如下：

式中，d1为抑菌圈直径，d2为长直径，d3为滤纸碟直径或洞穴直径，d4为短直径，D1为平均抑菌圈直径，D为重复的抑菌圈直径之和。

2 结果与分析

2.1 4种对峙培养测定方法的效果

观察比较4种方法发现，利用纸碟吸附药液的方式比利用打孔形成洞穴注入药液的方式效果更佳，操作更简便，能形成边界明显、透明的抑菌圈。在同样是利用纸碟吸附药液的方式中，划线和喷雾的方式接种病原细菌的方式各有优势。划线方式操作简单、不易污染，但是容易随着洒落在培养基表面的水蒸气变模糊；喷雾的方式均匀，但是操作较复杂、易污染。

如图1所示，划线+纸碟和喷雾+纸碟对峙方法效果好，其操作简单，抑菌圈透明度高、边界清晰。而划线+打孔和喷雾+打孔对峙方法效果差。故在6 种药剂防治烟草青枯病菌的室内防治试验中，选用划线+纸碟法进行药效的测定。

图1 同一浓度、不同方法中生·四霉素对烟草青枯病菌对峙培养的效果（依次为方法1、2、3、4）

2.2 6种药剂防治烟草青枯病菌的效果

从表2 可知，药剂1 号、2 号、3 号、4 号对烟草青枯病菌有抑制作用，5号、6号对烟草青枯病菌无抑制作用。其中抑制效果最好的是1 号，4 号药剂其次。从抑菌圈的形态上看，1 号药剂（中生·四霉素）对青枯病菌的对峙产生的抑菌圈是透明、边缘清晰和界限明显的，且平均抑菌圈直径在中浓度和最大浓度下分别为16.5 mm 和28.5 mm，说明该杀菌剂对该病害的防治效果最佳。4 号药剂1 000 亿芽孢/g 枯草芽孢杆菌可湿性粉剂抑制效果较好，平均抑菌圈直径在中浓度和最大浓度下分别为22 mm 和13 mm，抑菌圈为半透明、边缘较清晰、界限较明显。

表2 采用纸碟+划线法对6种药剂的药效进行测定后的平均抑菌圈直径和形态

3 分析与结论

烟草青枯病是常见的细菌性病害，目前利用药剂防治该病害仍然是主要的方法，因而研究在室内对病原细菌进行药剂对峙试验，筛选出效果好的药剂进行防控，对大田防治具有十分重要的意义。

研究设计划线和喷雾2种接种细菌方法，纸碟和洞穴2 种投放药剂方法。组合形成4种不同室内对峙试验的方法，即划线+纸碟法、划线+打孔法、喷雾+纸碟法、喷雾+打孔法，考察4 种方法的测定效果，并选取最优方法考察中生·四霉素、木霉菌；春雷·中生、枯草芽孢杆菌、中生菌素、哈茨木霉菌6 种杀菌剂对烟草青枯病菌的抑制效果。结果表明，利用纸碟比洞穴投放药剂的效果好，即划线+纸碟和喷雾+纸碟对峙方法效果好，划线+纸碟法操作简单，抑菌圈透明度高、边界清晰，使其与纸碟中的药剂产生抑制效应，进而产生抑菌圈，相比于“改良抑菌圈法”产生的抑菌圈操作较简单、直观、可量化［4］，在操作过程中推荐使用；6 种杀菌剂中，中生·四霉素、春雷·中生、2亿孢子/g木霉菌可湿性粉剂和1 000 亿芽孢/g 枯草芽孢杆菌可湿性粉剂对烟草青枯病菌均产生了抑制作用，前两者是化学杀菌剂，后两者是微生物药剂。从抑菌圈的形态上看，1 号药剂（中生·四霉素）对青枯病菌的对峙产生的抑菌圈表现为透明、边缘清晰、界限明显，且平均抑菌圈直径在中浓度和最大浓度下分别为16.5 mm 和28.5 mm，说明该杀菌剂对该病害的防治效果最佳。4 号1 000 亿芽孢/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂药剂抑制效果次之，平均抑菌圈直径在中浓度（推荐剂量）和最大浓度（最大剂量）下分别为22 mm和13 mm，抑菌圈呈半透明，边缘较清晰、界限较明显。化学药剂在防治烟草青枯病菌中的研究较多，且防治效果明显，但是化学药剂的副作用较大［5］，可在烟草生产种植中酌情使用。目前关于市面上微生物药剂对烟草青枯病菌的抑制作用的研究报道较少［6］，因此研究同时对常见的3 种微生物药剂的防治效果进行初步研究，结果发现木霉菌可湿性粉剂、枯草芽孢杆菌可湿性粉剂对烟草青枯病菌具有一定的抑制作用，且试验中从抑菌圈直径上观察，推荐剂量下，其抑制的效果大于春雷·中生这一化学药剂。

研究表明，1 000 亿芽孢/g 枯草芽孢杆菌可湿性粉剂药剂且平均抑菌圈直径在推荐剂量和最大剂量下分别为22 mm 和13 mm，抑菌圈呈半透明、边缘较清晰、界限较明显。综合推荐剂量和药剂类型考虑，推荐剂量下1 000 亿芽孢/g 枯草芽孢杆菌可湿性粉剂可作为室内防治烟草青枯病菌的最佳微生物药剂，该发现对烟草病害的绿色防治具有十分重要的意义。但研究仍存在选取的微生物药剂不够丰富，且抑制的效果有待提高等不足，需对微生物药剂和烟草根围土壤拮抗微生物的筛选试验进一步研究，为烟草青枯病菌防治提供更科学的参考依据。