损伤程度对甘薯黑斑病侵染特性的影响

庞林江,陆国权,李 云,李晓慧,成纪予,路兴花

（1.浙江农林大学食品与健康学院，浙江杭州311300；2.贵州省生物技术研究所，贵州贵阳550006；3.贵州省园艺研究所,贵州贵阳550006）

甘薯富含维生素、钾、铁、钙、膳食纤维等营养物质［1］，具有保健功效和较强的抗氧化特性，是人们喜爱的食物之一。但若贮藏方式不当或贮藏环境不适宜，易受到病原菌侵染，导致甘薯发生腐烂变质，造成巨大经济损失［2］。甘薯黑斑病是影响甘薯生产的主要病害之一，在甘薯的栽培和贮藏期间均会发生，对薯苗与薯块均有危害。我国每年由该病害导致的甘薯产量损失达5%～10%，严重时甚至高达20%～50%［3］。黑斑病会造成甘薯表皮形成黑色斑块，味苦，有毒。被牛、猪、犬等家畜误食，会引发气喘、中毒，严重时会导致死亡［4］。黑斑病产生的毒素主要有甘薯酮、甘薯醇、甘薯宁和4-薯醇等，这些毒素耐高温，甘薯蒸煮烤或制酒发酵等处理，都不易破坏毒素［5］。目前学者关注较多的是甘薯黑斑病的防治方向［6］，对其传播特性的研究鲜有报道。已有研究表明烟薯25对黑斑病具有高抗性［7］，但心香品种具有高感性。以心香、烟薯25 为试验材料，研究两个甘薯品种在黑斑病菌侵染后病斑的生长情况和侵染特性，以期为甘薯生产和贮藏过程中的黑斑病防治提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

甘薯品种：心香和烟薯25，于2019年7月采集自浙江杭州甘薯试验场。黑斑病病菌：由江苏省徐淮地区徐州农业科学研究所提供，需置于4℃冰箱保存。

试剂：马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）为生化试剂，购于青岛高科园海博生物技术有限公司。

仪器设备：SW-CJ-1CU 洁净工作台（苏州苏洁净化设备有限公司），LDZX-50KBS立式高压蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂），DRP-9162 型电热恒温培养箱（上海森信实验仪器有限公司），智能低温冷藏箱（宁波普朗特仪器有限公司），XSZ-H 生物显微镜（重庆光电仪器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 菌株的活化 将4℃保存的黑斑病菌置于28℃恒温培养箱复温24 h，然后在无菌环境中转接到新的PDA 平板上，用封口膜封口，置于28℃培养基恒温培养7 d［8］，备用。

1.2.2 孢子悬浮液的制备 参照张婕等［9］的方法在黑斑病菌培养7 d 后向PDA 平板中加入少量无菌水，并用无菌接种环轻刮后，采用4 层擦镜纸过滤，并用血球计数板计数，无菌水稀释，配制成1×106CFU/mL 的孢子悬浮液，备用。

1.2.3 接种 分别挑选颜色大小一致、无损伤、无病虫害的心香和烟薯25 两个品种的甘薯，用自来水洗净，自然晾干。用75%的乙醇溶液擦拭［10］，放入无菌操作台。将每个品种甘薯分为3组，分别做无损伤、表皮损伤、薯肉损伤处理，心香无损伤、表皮损伤、薯肉损伤处理分别为A0、A1、A2，烟薯25 无损伤、表皮损伤、薯肉损伤处理分别为B0、B1、B2。两个品种的无损伤处理均在甘薯中间部位等距离处画2 个直径5mm 的圆。表皮损伤处理均在甘薯中间部位等距离处取2 个直径5mm 的圆，并剥去其表皮。薯肉损伤处理均用灭菌打孔器在甘薯中间部位等距离处取2 个直径为5 mm，深度为5 mm 的圆柱孔［11］。用一次性注射器取25 μL 的黑斑病菌孢子悬浮液涂抹于圆内或注入孔洞，晾干，置于温度为28℃、相对湿度为90%的环境中贮藏。每隔3 d测定相关指标。

1.3 考察指标的测定

1.3.1 病斑表面直径 在甘薯表面病斑处采用十字交叉法进行测量［12］，每个处理重复6次。

1.3.2 病斑内部直径 将甘薯接种处横向切开，测量病斑横截面1/2 处的直径，每个处理重复6次。

1.3.3 病斑深度 将甘薯接种处横向切开，测量病斑深度，每个处理重复6次。

1.3.4 病斑面积 取横截面的面积。计算方法：

病斑面积=病斑内部直径×病斑深度—孔洞面积

1.3.5 腐烂指数 采用腐烂指数法［13］，依甘薯腐烂的面积划分为0～5 级：0 级（无腐烂）、1 级（腐烂的面积≤10%）、2 级（腐烂的面积介于10%～30%）、3 级（腐烂的面积介于30%～50%）、4 级（腐烂的面积介于50%～70%）、5 级（腐烂的面积≥70%）。计算方法：

1.4 数据处理

采用origin 2018软件对试验数据进行作图，并用SPSS 22.0 统计软件进行Tukey 法组间显著性分析，P＜0.05 表示具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 甘薯浸染黑斑病后的症状

从图1 可知，随贮藏时间的延长，黑斑病病斑的传播范围也越广，不同损伤程度的侵染严重程度依次为薯肉损伤＞表皮损伤＞无损伤。经15 d 贮藏后，A0和B0处理均无黑斑产生，A1和B1处理的病变程度相近，A2病变程度明显比B2处理深，这与辛国胜等［7］得出的烟薯25是抗黑斑品种的结论一致。

图1 不同损伤程度的甘薯贮藏15 d后黑斑病浸染症状

2.2 甘薯感染黑斑病后病斑表面直径的变化

由图2可知，不同损伤程度的甘薯在接种黑斑病病原菌贮藏15 d 后，不同品种的无损伤甘薯均未产生病斑，受损伤的甘薯均产生不同程度的黑斑病病斑，且薯肉损伤甘薯的黑斑病病斑的表面直径均大于表皮损伤的甘薯，且病斑的表面直径随贮藏时间的增加均呈上升趋势。在贮藏期间，B2和B1处理的表面直径均分别高于A2和A1处理，表明病原菌会刺激烟薯25表面病斑向周围表皮蔓延的速度。贮藏到第15 天两个品种薯肉损伤的表面直径大小接近，均在15 mm 以上，而表皮损伤的烟薯25 达到了21.67 mm，较相同处理的心香增加了39.46%。

图2 不同损伤程度甘薯感染黑斑病后病斑的表面直径

2.3 甘薯感染黑斑病后病斑内部直径的变化

由图3 可知，在病原菌胁迫下，受到损伤的甘薯病斑内部直径均随着贮藏时间的延长呈现上升趋势，均从5 mm 增加到13 mm 以上，且贮藏6～12 d，薯肉损伤的烟薯25 的病斑生长迅速，在第12 天时比相同处理的心香高23.29%。而贮藏12～15 天是薯肉损伤的心香病斑的加速生长期，在第15 天时其内部直径超越了烟薯25，达10.75 mm，较烟薯25增加20.93%，且显著高于其他处理，而未损伤的甘薯未形成病斑。

图3 不同损伤程度的甘薯黑斑病病斑的内部直径

2.4 甘薯浸染黑斑病后病斑深度的变化

由图4 可知，在黑斑病病原菌胁迫下，受到损伤的心香和烟薯25黑斑病病斑深度均随着贮藏时间的延长呈上升趋势。薯肉损伤的甘薯病斑深度始终高于表皮损伤的甘薯，心香品种表现尤其明显，而未损伤的甘薯则未被病原菌侵染。贮藏前6 d，病原菌的侵染速度较为缓慢，而在7～15 d 时甘薯的病斑深度急剧增大。贮藏到第15天薯肉损伤的心香病菌侵染程度最严重，病斑深度较薯肉损伤的烟薯25增加48%。

图4 不同损伤程度甘薯黑斑病的病斑深度

2.5 甘薯浸染黑斑病后病斑面积的变化

由图5 可知，在病原菌胁迫下，受到损伤的甘薯病斑面积随着贮藏时间的延长呈上升趋势，而未损伤的甘薯没有被病原菌侵染。贮藏到第15 天，心香薯肉损伤处理的病斑面积急速增长，达215.75 mm2，分别比烟薯25薯肉损伤处理、心香表皮损伤处理、烟薯25表皮损伤处理显著增加58.05%、86.17%、87.41%（P＜0.05）。薯肉损伤的甘薯病斑面积始终远高于表皮损伤的甘薯处理，表明甘薯损伤程度越严重，越容易被病原菌侵染产生黑色病斑且迅速生长。相对心香品种，烟薯25 表现出较好的抗性，这与烟薯25 本身具有的抗黑斑病性质一致。

图5 不同损伤程度甘薯黑斑病病斑面积

2.6 甘薯不同损伤程度对腐烂指数的影响

由表1 可知，随着贮藏时间的延长，未损伤的甘薯不易被黑斑病病原菌侵染，而有伤口的甘薯均会被侵染，出现腐烂现象。薯肉损伤的心香腐烂指数在贮藏期间显著高于其他处理（P＜0.05），在贮藏第15 天时，心香薯肉损伤处理的腐烂指数高达86.67%，烟薯25 薯肉损伤处理的腐烂指数为60%，均大于50%，而表皮损伤的甘薯腐烂指数均小于30%。可见，薯肉部位损伤的甘薯更易感染黑斑病。贮藏到第15 天，心香薯肉损伤和表皮损伤处理的腐烂指数显著高于烟薯25（P＜0.05）。

表1 不同损伤程度甘薯黑斑的腐烂指数 %

3 结论

研究表明，心香和烟薯25 品种的表皮损伤和薯肉损伤均会受到黑斑病病原菌的侵染而产生病斑，且病斑表面直径和内部直径均会随着贮藏时间的延长而增长，病斑深度和病斑面积也会增加，腐烂指数不断上涨；而无损伤的甘薯能抵抗病原菌的侵染，不会发生病变。因此，损伤是甘薯抵抗病原菌侵染的最主要因素，伤口是病原菌侵染的主要途径，与采后苹果青霉菌［14］的扩展入侵方式一致。研究发现，病斑在前6 天传播速度较为缓慢，7～15 d病斑呈快速增长趋势。

随着贮藏时间的延长，薯肉损伤的甘薯比表皮损伤甘薯的侵染传播速度更快，病斑深度、面积、腐烂指数远高于表皮损伤，表明薯肉部位比表皮部位更易遭受病原菌的侵染，表皮对甘薯抵抗侵染有一定保护作用。贮藏到第15 天，两种甘薯表皮损伤的病变程度相当，而薯肉损伤的心香除表面直径略小于烟薯25外，内部直径、深度、面积、腐烂指数均高于烟薯25。这是因为不同抗性品种的甘薯对黑斑病病原菌具有不同的抗性，其侵染变化特性也不同，黑斑病抗性较弱的心香品种更易受到病原菌的侵染，病斑以纵深传播为主，且传播速度快，受到的侵染程度严重。黑斑病抗性品种烟薯25的黑斑病病斑以表面横向传播为主，与心香品种的纵深传播不同，这可能与甘薯内部的酶代谢等有关。