原儿茶酸对LPS诱导的小鼠子宫内膜炎的作用机制研究

张玉珠，于 超，郑慧华，唐欣悦，黄荣磊，谢光洪

（吉林大学动物医学学院,长春 130062）

子宫内膜炎是一种感染性和炎症性的子宫内膜疾病，严重危害着人类和动物的生殖系统[1]。研究表明，在小动物临床中约25%未绝育的母犬在10岁前会发生子宫疾病（子宫内膜炎、子宫蓄脓等）[2]，而大肠杆菌被认为是引发子宫内膜炎的最重要因素[3]。如果不治疗，母犬可能会发展为内毒素血症、败血症或败血性休克，从而危机生命[4]。脂多糖（LPS）是革兰氏阴性菌外壁的主要组成成分，一旦进入机体，对机体产生刺激，便会激活机体中宿主细胞细胞膜表面的Toll样受体4（TLR4）信号通路，随后导致其下游介质中核因子-κB（NF-κB）的激活,会释放炎性细胞因子（如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）和IL-6等），从而导致机体损伤[5]，也会导致细胞质中的NF-κB抑制剂（IκB）蛋白与p65从失活状态发生磷酸化（p-p65和p-IκB），从而启动炎性细胞因子转录，诱发炎症反应[6]。髓过氧化物酶（MPO）是一种血红素蛋白，是中性粒细胞的主要组成成分，MPO活性越高，说明炎症反应越强烈[7]。上述指标均可用于判断LPS诱导建立的小鼠子宫内膜炎模型是否成功。研究表明，抑制NF-κB信号通路对子宫内膜炎具有保护作用[8]。因此，寻找一种能够抑制NF-κB信号通路的药物对子宫内膜炎的治疗是非常重要的。

目前，对子宫内膜炎的治疗主要依赖抗生素，但抗生素的使用导致耐药性和药物残留增加，已成为小动物临床和养殖业的一大隐患[9]。因此，亟待寻找一种治疗子宫内膜炎的新方法。近年来，中药因其安全性好、毒副作用少、无残留等优点在临床用药中越来越受重视，在辅助治疗炎症性疾病方面也越来越受重视，因此中药及其活性成分的研究与开发也成为了人们关注的热点。原儿茶酸是花青素的酚类化合物，存在于水稻、洋葱、迷迭香、肉桂、芙蓉、丹参等中[10]，具有广泛的药理活性，如抗炎、抗氧化等[11]。研究表明，原儿茶酸可改善LPS刺激引起的仔猪肠道炎症反应[12]；可通过调节NF-κB通路抑制LPS激活的BV2小胶质细胞炎症反应[13]；还可以通过调节HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路抑制急性胰腺炎的炎症反应[14]，然而原儿茶酸对子宫内膜炎是否具有抑制炎症反应尚不清楚。本试验利用LPS建立小鼠子宫内膜炎模型，通过检测子宫组织的病理变化、MPO活性、炎性因子含量以及NF-κB信号通路相关蛋白来探讨原儿茶酸对LPS诱导的小鼠子宫内膜炎的作用机制，以期为将原儿茶酸用于临床上治疗炎症提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物及其饲养管理

60只健康BALB/c小鼠购自辽宁长生生物技术股份有限责任公司，雌性，6～8周龄，体重18～22 g，于室温（24±1）℃、相对湿度55%、12 h循环光照适应1周，将小鼠随机分为5笼，每笼各12只，饲喂常规饲粮，自由进食和饮水。

1.2 主要试剂

原儿茶酸（纯度>98%）购自成都优选生物技术有限公司；LPS购自Sigma公司；MPO测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所；TNF-α、IL-1β和IL-6 ELISA试剂盒均购自Biolegend公司；抗NF-κB p65和IκB抗体均购自Danvers公司；Anti-mouse和Anti-rabbit二抗均购自CST公司；胎牛血清购自CLARK公司；ECL化学发光试剂和BCA蛋白浓度测定试剂盒均购自Thermo公司；PBS缓冲液购自Solarbio公司。

原儿茶酸配制：称取40 mg原儿茶酸溶于1 mL DMSO中配成40 mg/mL溶液，待药物完全溶解后，分装到EP管中于-20 ℃保存待用。根据小鼠具体体重和不同浓度原儿茶酸（20、40、80 mg/kg）组计算所需剂量，然后用生理盐水稀释到400 μL。

LPS配制：以PBS溶解，配成10 mg/mL，-20 ℃保存，使用时室温解冻后，稀释10倍配成浓度为1 mg/mL的LPS溶液。

1.3 试验动物分组及处理

60只小鼠随机分为对照组、LPS组、LPS+不同浓度原儿茶酸（20、40、80 mg/kg）组共5组，每组各12只。 对照组小鼠用微量注射器经阴道灌注50 μL生理盐水，LPS组灌注50 μL LPS（1 mg/mL，溶解于无菌PBS中）[8]， 原儿茶酸治疗组灌注50 μL LPS前1 h分别腹腔注射20、40、80 mg/kg原儿茶酸，注射24 h后，颈椎脱臼法处死所有小鼠，收集子宫组织，一部分用10%福尔马林固定，一部分于-80 ℃保存待测。

1.4 测定指标及方法

1.4.1 组织病理变化检测 子宫组织在10%福尔马林中固定24 h以上，经过脱水、组织透明后在石蜡液中浸蜡，制成石蜡组织块，并用切片机切成5 μm切片。将切片附在载玻片上，烘干。经过脱蜡、冲洗、HE染色后再脱水，透明后封片，镜检观察，采集图像。

1.4.2 MPO活性检测 取小鼠子宫组织，加入PBS于冰上进行称量和研磨，然后按照MPO检测试剂盒说明书检测子宫组织的MPO活性，用分光光度计测定D460 nm值。

1.4.3 炎性因子检测 采用ELISA法按照TNF-α、IL-6和IL-1β试剂盒说明书进行操作，用酶标仪测定D450 nm值，计算子宫组织中TNF-α、IL-6和IL-1β含量。

1.4.4 NF-κB信号通路相关蛋白检测 称取小鼠子宫组织，与PBS溶液按重量体积比为1∶9加入匀浆器中研磨，将匀浆液收集至EP管中，采用BCA法测定蛋白的浓度。通过SDS-PAGE进行分离后，利用湿转法将这些蛋白转移到PVDF膜上，用3%胎牛血清室温封闭3 h，与一抗（1∶1 000） 4 ℃孵育过夜，二抗（1∶20 000）室温孵育2 h。将PVDF膜置于化学发光成像系统，滴加ECL化学发光液进行显像，采集图像。用ImageJ 1.48软件进行灰度分析。

1.5 数据统计分析

用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析（One-Way ANOVA），结果用平均值±标准差表示。P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结 果

2.1 原儿茶酸对LPS诱导小鼠子宫组织的影响

由图1可知，对照组（图1A）小鼠子宫组织形态正常，子宫内膜上皮结构正常；LPS组小鼠子宫组织出现严重的炎性细胞浸润和子宫内膜上皮充血及水肿（图1B）。与LPS组相比，随着原儿茶酸浓度的增加，小鼠子宫组织中炎性细胞明显减少，子宫内膜上皮充血水肿情况也明显得到改善（图1C～1E）。

A，对照组；B，LPS组；C，LPS+20 mg/kg原儿茶酸组；D，LPS+40 mg/kg原儿茶酸组；E，LPS+80 mg/kg原儿茶酸组A,Control group;B,LPS group;C,LPS+20 mg/kg protocatechuic acid group;D,LPS+40 mg/kg protocatechuic acid group;E,LPS+80 mg/kg protocatechuic acid group图1 各组小鼠子宫组织病理变化（100×）Fig.1 Pathological changes of mouse uterus tissues in each group （100×）

2.2 原儿茶酸对LPS诱导小鼠子宫组织MPO活性的影响

由图2可知，与对照组相比，LPS组MPO活性极显著升高（P<0.01）；与LPS组相比，原儿茶酸治疗组MPO活性均极显著降低（P<0.01），并呈剂量依赖性。结合病理检测中对照组和LPS组病理变化，说明LPS诱导的小鼠子宫内膜炎模型构建成功。

①1～5，分别代表对照组、LPS组、LPS+20 mg/kg原儿茶酸组、LPS+40 mg/kg原儿茶酸组、LPS+80 mg/kg原儿茶酸组。②与对照组相比，#，差异极显著（P<0.01）。③与LPS组相比，*，差异显著（P<0.05）；**，差异极显著（P<0.01）。下同①1-5,Control group,LPS group,LPS+20 mg/kg protocatechuic acid group,LPS+40 mg/kg protocatechuic acid group,LPS+80 mg/kg protocatechuic acid group,respectively.②Compared with control group,#，Extremely significant difference （P<0.01）.③Compared with LPS group,*,Significant difference （P<0.05）,**,Extremely significant difference （P<0.01）.The same as below图2 各组小鼠子宫组织MPO活性Fig.2 MPO activity of mouse uterus tissues in each group

2.3 原儿茶酸对LPS诱导小鼠子宫组织炎性因子的影响

由图3可知，与对照组相比，LPS组小鼠子宫内膜组织中炎性细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6含量均极显著升高（P<0.01）。与LPS组相比，原儿茶酸治疗组小鼠子宫内膜组织中炎性细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6含量均极显著降低（P<0.01），并呈剂量依赖性。

图3 各组小鼠子宫组织中炎性细胞因子含量Fig.3 Contents of inflammatory cytokine in uterine tissues of mice in each group

2.4 原儿茶酸对LPS诱导小鼠子宫组织NF-κB信号通路的影响

由图4可知，与对照组相比，LPS组p-p65和p-IκB蛋白的表达水平均极显著升高（P<0.01）。与LPS组相比，原儿茶酸治疗组p-p65和p-IκB的表达水平均极显著降低（P<0.01），且呈剂量依赖性。

图4 各组小鼠子宫组织NF-κB信号通路相关蛋白的表达Fig.4 Expressions of NF-κB signaling pathway related protein in uterine tissues of mice in each group

3 讨 论

子宫内膜炎是指子宫黏膜发生细菌感染而致的炎症，是导致动物不孕的重要原因之一[15]。在小动物临床，常发生于未绝育成年母犬，病原微生物感染被认为是主要的发病原因[16]。而LPS是革兰氏阴性菌外壁的主要组成成分，广泛用于炎症相关领域研究，如急性肺炎[17]、急性肝炎[18]、心肌炎[19]等。原儿茶酸是花青素的主要生物活性代谢产物，存在于杜仲、高寒和冬青等植物体内，且具有抗氧化[20]、抗炎作用[21]。本研究中，LPS作用于小鼠子宫引发子宫内膜发生炎性反应，导致子宫内膜发生严重的病理改变，如严重的炎性细胞浸润和子宫内膜上皮充血且水肿。而原儿茶酸的治疗组炎性细胞浸润减少，子宫内膜的充血、水肿减轻，这说明原儿茶酸可以有效改善小鼠子宫内膜炎的病理损伤。MPO是中性粒细胞富含的蛋白质[7]，其活性越高，说明炎症反应越剧烈。本试验研究结果表明，与对照组相比，LPS诱导的小鼠子宫内膜组织中中性粒细胞增多且MPO活性增高，而经原儿茶酸治疗后MPO活性显著降低，说明原儿茶酸对LPS诱导的子宫内膜炎能起到保护作用，降低炎性反应，减少中性粒细胞的浸润，且随着浓度的增高，效果更加显著。

炎症是机体对于刺激的一种防御反应，而过度的炎症反应会导致机体发病。研究表明，许多炎症细胞因子的产生与疾病发生过程中的炎症有关，而炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6在子宫内膜炎的发生中发挥了重要作用[22]，这些炎症因子会对子宫和子宫组织造成损伤。本试验结果表明，LPS可诱导炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的释放，而原儿茶酸可显著降低LPS诱导的小鼠子宫内膜组织中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量，表明原儿茶酸可通过抑制促炎细胞因子的产生发挥抗炎作用。因此，抑制炎症细胞因子的产生可能是治疗子宫内膜炎的一个靶点。NF-κB是脊椎动物的一个主要的转录因子，在炎症、免疫、细胞增殖和凋亡中发挥重要作用[23]。当机体炎症升高，会刺激NF-κB信号通路活化，从而导致IκB和p65磷酸化表达增加[6]。本试验结果表明，LPS处理的小鼠子宫内膜中p-p65和p-IκB的表达水平均极显著增加，原儿茶酸治疗极显著降低了p-p65和p-IκB的表达，从而抑制NF-κB的活性。因此，原儿茶酸能够抑制LPS诱导小鼠子宫内膜炎中NF-κB信号通路的激活，从而对小鼠子宫内膜炎起到保护作用。

4 结 论

本研究结果表明，原儿茶酸可通过减少LPS处理的小鼠子宫组织中的炎性细胞，减轻子宫内膜的充血、水肿，降低子宫组织MPO活性，抑制TNF-α、IL-1β和IL-6的产生及NF-κB信号通路的激活，从而对LPS诱导的小鼠子宫内膜炎起到保护作用。