犬猫皮肤病细菌性病原分离鉴定及天然产物抑菌效果分析

赵天睿，邵锦华,王朝好，严 蕊，雷镒妃，刘晓雅，胡长敏

（1.华中农业大学动物医学院，武汉 430070；2.广州海关隶属广州会展中心海关，广州 510335）

犬猫皮肤病是临床上常见疾病之一，具有发病率高且易复发的特点。犬猫皮肤病会导致一系列症状，如原发性感染引发的表皮红肿、瘙痒、疱疹和继发性感染引发的脓肿。同时，皮肤病易导致动物抓挠等异常行为[1]，导致动物福利受损。细菌性皮肤病是由细菌性病原感染引起的皮肤病理变化，为皮肤病中最重要的一种。常见的细菌性皮肤病病原有金黄色葡萄球菌、猫葡萄球菌、中间型葡萄球菌、伪中间型葡萄球菌、链球菌、奇异变形杆菌、化脓性棒状杆菌及假单胞菌等[2]。据报道，人畜共患病原中，有30～40种病原来自犬猫[3]。由于许多犬猫皮肤病病原具有人畜共患的特性，易造成病原在动物与人之间的传播并引发公共卫生问题。

犬猫细菌性皮肤病的临床诊断可通过病史、症状进行初步判定，随后开展皮肤抹片镜检、细菌分离培养、药敏试验等实验室检查[4-5]。目前,临床上常见的皮肤病治疗用药一般为抗生素，而抗生素的滥用也导致了耐药性等一系列问题[6]。因此，许多研究者开始关注植物类产物[7]，并从中筛选到多种具有活性的化学物质。这些天然活性产物具有低毒、安全、环境友好的特点，其中多种天然活性产物兼具抑菌作用，既可作为传统抗菌药物的替代物[8]，也可与抗生素联用以降低耐药菌的抗药性，如白花丹中提取的白花丹素可抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin resistantStaphylococcusaureus,MRSA）的增殖[9]，血根碱可抑制大肠杆菌[10]，芫荽中的芳樟醇可与苯唑西林、庆大霉素等联用抑制MRSA及铜绿芽孢杆菌的活性[11]。除此以外，部分天然活性产物还具有免疫调节机能[12]，显著促进患有细菌性皮肤病犬猫的康复。

研究显示，藤黄酸（gambogic acid,GA）具有抑制肿瘤细胞增殖[13]及神经保护[14]等作用，6-溴靛玉红-3’-肟（6-bromoindirubin-3’-oxime,BIO）有抑癌[15]、延缓心肌细胞衰老[16]等功效。本实验室前期研究证实了BIO及GA有较好的抑制炎症的功效[17-18]。本研究拟对武汉市患皮肤病的犬猫开展细菌性病原分离鉴定，并探索其对传统抗菌药物与天然活性产物GA及BIO的敏感性，以期为临床上犬猫皮肤病的治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物及菌株 病例来自武汉市部分犬舍、猫舍及某动物医院的患皮肤病犬猫。5周龄体重20 g左右的雌性SPF级昆明小鼠购自华中农业大学实验动物中心。质控菌株金黄色葡萄球菌 ATCC 25923与ATCC 29213及大肠杆菌 ATCC 25922均购自温州市康泰生物科技有限公司康泰菌株保藏中心。

1.1.2 主要试剂 GA标准品、BIO标准品及头孢西丁标准品均购自上海源叶生物科技有限公司；培养基均购自青岛海博生物技术有限公司；革兰氏染色试剂盒购自南京建成科技有限公司；TaqDNA 聚合酶、dNTPs、DL2000 Plus DNA Marker均购自宝生物工程（大连）有限公司；二甲基亚砜（DMSO）购自Thermo Fisher Scientific公司；药敏纸片购自杭州微生物试剂有限公司；细菌生化鉴定管购自杭州滨和微生物试剂有限公司。

1.1.3 药物配制与保存 将GA及BIO标准品溶于DMSO分别配制成1 000和2 000 mg/L溶液并于4 ℃避光保存，试验前将其分别稀释25倍，以保证DMSO终浓度<1%。头孢西丁标准品用水配制成1 000 mg/L的溶液。药物浓度见表1。

表1 药物浓度Table 1 Drug concentration mg/L

1.2 方法

1.2.1 采样 无菌生理盐水清洁病变处，用一次性无菌棉拭子进行采样并将棉拭子头保存于2 mL EP管中。

1.2.2 样品处理 将棉拭子于TSA平板一区进行划线，再用接种环进行余下三区划线。37 ℃倒置培养12～24 h，观察分辨平板上的绝对优势菌落并挑取单菌落，接种于 TSB 培养基。

1.2.3 菌种保藏 取800 μL甘油及等体积菌液存于2 mL EP管中，置于-20 ℃冰箱保存。

1.2.4 病原菌鉴定

1.2.4.1 生长特性观察 将菌种按1%浓度接种于TSB培养基，37 ℃培养16～20 h；复苏后挑取一环菌液，于TSA 平板上四区划线，37 ℃倒置培养16～20 h后，观察菌落形态。

1.2.4.2 革兰氏染色镜检及生化鉴定 制作细菌抹片，利用革兰氏染色试剂盒进行染色并镜检。生化鉴定：将菌液接种至细菌生化鉴定管，37 ℃培养24 h，观察结果。

1.2.4.3 分子生物学鉴定 以煮沸法提取各菌株DNA，以提取的基因组 DNA 为模板，用细菌16S rRNA通用引物（27F/1492R）进行PCR，扩增目的片段，用葡萄球菌属特异性引物（Staph 756F/Staph 750R）[19]、变形杆菌属特异性引物（TUF F/TUF R）[20]、链球菌特异性引物（EF-TU F/EF-TU R）[21]分别扩增疑似菌株。16S rRNA PCR反应体系25 μL：上、下游引物各 1 μL，2×TaqMaster Mix 12 μL，DNA模板 2 μL，灭菌ddH2O 8.5 μL。16S rRNA PCR 反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共30个循环；72 ℃延伸7 min。葡萄球菌[22]、变形杆菌[23]、链球菌[24]的PCR反应条件按照文献方法进行。PCR 产物经 1.0% 琼脂糖凝胶电泳验证。扩增后出现与目的条带大小相近的条带，则判为PCR扩增阳性并送至北京奥科鼎盛生物科技有限公司进行测序，测序结果在 BLAST进行相似性比对，以确定分离菌株种属。

1.2.5 皮肤感染模型复制 为验证分离菌株的致病性，对其进行皮肤感染模型复制试验。选取体重20 g以上的SPF 昆明小鼠20只，每组2只,共计10组，将1～9组设为试验组,10组设为对照组。在其背部皮肤选取一处进行剃毛，并将皮肤用刮刀刮至皮下出血且皮肤无破损，用棉拭子蘸取菌液涂抹于试验组小鼠受试部位，对照组涂布TSB培养基，连续3 d。每组小鼠分笼饲养于SPF动物房，3 d后观察受试部位病变情况，并对病变位置重新进行取样、分离及鉴定。

1.2.6 临床分离菌株对传统抗菌药的耐药性测定 根据美国临床和实验室标准协会（Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI）给出的参考，选择能在该标准中查询到具体抑菌圈数据的对应药物，采用K-B纸片法进行分离菌株对传统抗菌药物耐药性测定。选择大肠杆菌ATCC 25922及金黄色葡萄球菌ATCC 25923作为质控菌株。

1.2.7 天然活性产物的MIC试验 通过肉汤稀释法测定天然活性产物GA及BIO对各临床菌株的最小抑菌浓度（MIC）值，并设置大肠杆菌ATCC 25922和金黄色葡萄球菌ATCC 29213为质控菌株，头孢西丁为质控药物。

2 结 果

2.1 病原菌分离鉴定结果

2.1.1 生长特性 采样后对样品进行分离纯化，最终获得9株细菌。将临床分离的9株菌依次编号为F1、F2、C3、C4、F5、C6、C7、C8和F9,分别接种至TSA平板，经37 ℃培养16～20 h后，F2、C4、F5（图1A）和F9（图1B）形成表面光滑、湿润、直径为1～2 mm的黄白色圆形菌落；C6、C7、C8（图1C）成表面光滑、湿润、直径1 mm左右的白色圆形菌落；C3出现表面粗糙、边缘不平滑、直径1 mm左右的白色圆形菌落（图1D）；F1形成表面光滑、湿润、直径0.5～1 mm的灰白色圆形菌落（图1E）。

A，F5;B，F9;C，C8;D，C3;E，F1图1 犬猫皮肤病病原在TSA平板上的生长特性Fig.1 Growth characteristics of skin pathogenic bacteria from dogs and cats on TSA plates

2.1.2 革兰氏染色结果 在镜下，F2、F4、F5、C6、C7、C8、F9呈蓝紫色，为革兰氏阳性，球形或稍呈椭圆形，直径1.0 μm左右，排列成葡萄状（图2A～2C）；C3呈红色，为革兰氏阴性，长约1.0～3.0 μm，两端钝圆（图2D）；F1呈革兰氏阳性，球形或卵圆形，直径0.6～1.0 μm，大多为链状排列（图2E）。

A，F5;B，F9;C，C8;D，C3;E，F1图2 革兰氏染色结果（1 000×）Fig.2 Gram staining results （1 000×）

2.1.3 生化鉴定 由表2可知，F2、F9、C4、F5、C6、C7、C8对乳糖、甘露糖等均呈现阳性，C4和F5 V-P实验、硝酸盐还原实验呈阳性，其他5株V-P实验、硝酸盐还原实验为阴性。

表2 F2、C4、F5、C6、C7、C8、F9生化鉴定结果Table 2 Biochemical identification results of F2,C4,F5,C6,C7,C8 and F9

另外，F1对PYR、精氨酸、MAG、TMZ、蕈糖、蔗糖表现为阳性，对V-P、GPP、七叶苷、山梨醇表现为阴性。C3对V-P、苯丙氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、枸橼酸盐、尿素、硫化氢、磷酸酶、β-半乳糖苷、棉籽糖、戊糖、山梨醇、二磷酸酶表现为阳性，对靛基质、侧金盏花醇表现为阴性。

2.1.4 PCR检测16S rRNA及属特异性基因的结果 提取分离得到的9株细菌的DNA，用细菌通用引物（27F/1492R）扩增细菌的16S rRNA基因序列，由图3可知，9株菌均扩增出了1 500 bp左右的条带，阴性对照无条带。

M,DL2000 Plus DNA Marker；N,ddH2O；1～9,依次为F1、F2、C3、C4、F5、C6、C7、C8和F9M,DL2000 Plus DNA Marker;N,ddH2O;1-9,F1,F2,C3,C4,F5,C6,C7,C8 and F9,respectively图3 病原菌16S rRNA PCR产物电泳结果Fig.3 Electrophoresis results of 16S rRNA PCR products of pathogenic bacteria

葡萄球菌属特异性引物扩增后，F2、C4、F5、C6、C7、C8、F9均出现756 bp条带，说明该7株菌均为葡萄球菌（图4A）；变形杆菌属特异性引物扩增后，C3出现541 bp 条带（图4B）；链球菌属特异性引物扩增后，F1出现 197 bp 条带（图4C）。对扩增结果进行测序及BLAST比对，确定F2、F9为猫葡萄球菌，C4、F5为金黄色葡萄球菌，C6、C7、C8为伪中间型葡萄球菌，C3为奇异变形杆菌，F1为犬链球菌。

①A,葡萄球菌；B,变形杆菌；C,链球菌。②M，DL2000 Plus DNA Marker；N，ddH2O；1～9，分别为F2、C4、F5、C6、C7、C8、F9、C3和F1①A,Staphylococcus;B，Proteus;C，Streptococcus.②M,DL2000 Plus DNA Marker；N,ddH2O；1-9,F2,C4,F5,C6,C7,C8,F9,C3 and F1,respectively图4 菌属特异性引物扩增病原菌对应基因片段的PCR产物电泳结果Fig.4 Electrophoresis results of PCR products of corresponding gene fragment amplified by specific bacterial primers

2.2 临床分离菌株皮肤感染模型复制结果

在连续对试验组SPF小鼠受试部位涂抹菌液3 d、对照组SPF小鼠涂抹TSB培养基3 d后观察，试验组小鼠受试部位出现病变，对照组未见病变，说明各临床菌株均具有致病性。涂抹伪中间型葡萄球菌小鼠，其受试部位出现3 mm×7 mm的病变，并形成较厚、表面粗糙的黑红色血痂（图5A）；涂抹犬链球菌菌液的小鼠于受试部位形成一处略凹陷、表面粗糙的暗红色病变（图5B）；涂抹猫葡萄球菌菌液的小鼠于受试部位出现6 mm×3 mm的病变，并形成红褐色痂皮（图5C）；涂抹金黄色葡萄球菌菌液的小鼠于受试部位出现明显的起皮、掉屑，并在病灶中心形成淡黄色痂皮（图5D）；涂抹奇异变形杆菌菌液的小鼠于受试部位出现一处较小的表面较厚的血痂（图5E）；对照组小鼠在3 d后背部经刮刀刮出的渗血在逐渐消退，于皮下留下淡红色痕迹（图5F）。

A，伪中间型葡萄球菌;B，犬链球菌;C，猫葡萄球菌;D，金黄色葡萄球菌;E，奇异变形杆菌;F，对照组A，Staphylococcus pseudintermedius;B， Streptococcus canis;C，Staphylococcus felinae;D，Staphylococcus aureus;E，Proteus mirabilis;F，Control group图5 小鼠受试部位病变情况Fig.5 Pathological changes in the tested parts of mice

2.3 分离菌株耐药性结果

2.3.1 分离菌株对传统抗菌药物的耐药性 根据临床菌株的类别，开展分离菌株对传统抗菌药物的耐药性测定，即葡萄球菌组、犬链球菌组及奇异变形杆菌组对抗生素的耐药情况。由表3可知，猫葡萄球菌F2、伪中间型葡萄球菌C6对复方新诺明、青霉素、苯唑西林等10种抗菌药均敏感，金黄色葡萄球菌C4对青霉素耐药，金黄色葡萄球菌F5对复方新诺明、青霉素、氯霉素、红霉素耐药，伪中间型葡萄球菌C7对复方新诺明、青霉素、氯霉素、红霉素、庆大霉素耐药，猫葡萄球菌F9、伪中间型葡萄球菌C8对复方新诺明、青霉素、苯唑西林、氯霉素、红霉素、克林霉素、四环素、左氧氟沙星耐药。由表4可知，犬链球菌F1对万古霉素、利福平等8种抗菌药均敏感。由表5可知，奇异变形杆菌C3对呋喃妥因、氨苄西林等6种抗菌药均敏感。

表3 7株葡萄球菌对10种抗菌药的耐药情况Table 3 Resistance of 7 strains of Staphylococcus to 10 traditional antibiotics

表4 1株犬链球菌对8种抗菌药的耐药情况Table 4 Resistance of 1 strain of Streptococcus to 8 traditional antibiotics

表5 1株奇异变形杆菌对6种抗生素的耐药情况Table 5 Resistance of 1 strain of Proteus to 6 traditional antibiotics

2.3.2 天然产物GA及BIO的MIC结果 天然活性产物GA和BIO对临床分离菌株的MIC结果显示，GA及BIO对各临床分离菌株均具有较强的抑菌活性，其中GA对临床分离株的MIC在0.625～2.5 mg/L,BIO的MIC在2.5～5 mg/L（表6）。且在本试验中，除金黄色葡萄球菌F5外，GA的MIC值均小于BIO。

表6 2种天然活性产物对各菌株的MICTable 6 MIC of 2 natural active products to each strain mg/L

3 讨 论

细菌性皮肤病是由细菌性病原感染引起的皮肤病理变化，是最常见的一种犬猫皮肤病。免疫缺陷、内分泌功能障碍、皮肤创伤、真菌感染、特应性皮炎等病因导致皮肤菌群生态平衡失调[25]、皮肤抑制细菌滋生能力下降，进而引发细菌性感染。细菌性皮肤病不仅导致患病动物皮肤局部病变，严重时可能诱发全身感染。抗生素是临床上治疗细菌性皮肤病的常见手段，但存在疗效不确定、个体差异大、容易复发等问题[26]，且抗生素滥用导致的细菌耐药性问题也愈发严峻，影响了其治疗效果。从植物中提取的天然产物低毒且安全，其中有许多天然产物有一定的抑菌活性，具有作为替代抗生素成为犬猫皮肤病治疗药物的潜力，如植物提取物W16P57被证实对耐甲氧西林伪中间型葡萄球菌有抑制作用[27]。本实验室前期研究发现，GA可抑制促炎因子白介素-1β（IL-1β）、IL-6和肿瘤坏死因子-α（TNF-α） mRNA表达量及TLR4-NF-κB/MAPKs信号通路来抑制乳腺炎[18]，靛玉红也可下调上述炎性因子来达到抑炎效果[17]。

本研究首先对临床病样进行收集，并进行病原菌的分离与鉴定，共分离到9株细菌。在所分离病原中，葡萄球菌是犬猫最常见的皮肤病致病菌；犬链球菌是一种感染多种动物的致病菌，Pesavento等[28]报道证实了其单独感染也可导致猫皮肤病；亦有研究表明奇异变形杆菌对皮肤有致病性[29-30]。本研究使用SPF小鼠对临床分离株进行了皮肤病模型复制，为防止小鼠间撕咬、打斗、交配等行为影响试验结果，本试验中选择的均为雌性小鼠。最终成功复制了皮肤病模型，不仅说明犬猫源菌株在小鼠进行皮肤感染模型复制的可行性[31]，并且验证了临床分离株对皮肤的致病性。

本研究分离得到菌株对传统抗菌药物耐药性表现较大差异，其中1株犬链球菌及1株奇异变形杆菌在对传统抗菌药物耐药性的试验中表现为对受试药物全敏感；葡萄球菌中2株对受试药物全敏感（猫葡萄球菌F2、伪中间型葡萄球菌C6），1株对1种药物耐药（金黄色葡萄球菌C4），1株对4种药物耐药（金黄色葡萄球菌F5），1株对5种药物耐药（伪中间型葡萄球菌C7），2株对8种药物耐药（猫葡萄球菌F9、伪中间型葡萄球菌C8）。Beça等[32]从动物、兽医专业人员和临床兽医环境中分离到12株伪中间葡萄球菌，其中有4例为耐甲氧西林伪中间葡萄球菌。同时，对兽医专业人员手部进行采样，约有20%的样本可分离得到耐甲氧西林伪中间葡萄球菌,该研究表明葡萄球菌的耐药问题已较为突出。多重耐药菌株更对临床治疗带来巨大挑战[33]。在本研究中，葡萄球菌对传统抗菌药的耐药性也明显高于链球菌和变形杆菌。张文皓[34]报道的耐药性分析结果表明，葡萄球菌对氨基糖苷类（庆大霉素）及氟喹诺酮类（左氧氟沙星）敏感性较高，与本研究部分结果相符。

本研究进一步对天然活性产物GA及BIO的抑菌效果开展了评价，GA及BIO对犬猫皮肤病源菌株均有较好的抑菌效果。有研究表明GA对MRSA有抑菌效果[35]。王丹等[36]在关于GA的牛津杯试验中，观察到其浓度在20和2 mg/mL时均对金黄色葡萄球菌产生抑菌圈，对大肠杆菌均无抑菌圈。本研究中GA对于金黄色葡萄球菌的效果与王丹等[36]的试验结果相符。本研究中也检测到了GA对大肠杆菌ATCC 25922的抑菌作用，且GA对于该大肠杆菌菌株的MIC值大于所有受试葡萄球菌菌株，其差异原因可能为药敏试验方法的区别；其次，在本研究中应用的大肠杆菌为非临床菌株。

Czelen等[37]研究发现,靛玉红可通过抑制细胞周期蛋白依赖性激酶和 DNA 聚合酶来影响细菌生长。林健等[38]验证了靛玉红对MRSA的抑菌活性。在本研究中，选取了靛玉红的衍生物BIO进行试验，发现其对受试菌株均有抑菌活性;同时除金黄色葡萄球菌F5外，GA的MIC值均小于BIO，说明GA对于本次分离得到的菌株抑菌效果更强。

4 结 论

本研究从武汉市部分皮肤病患病犬猫分离得到共计5种、9株临床菌株，并通过小鼠皮肤感染模型验证了其对皮肤的致病性。上述部分临床分离株对传统抗菌药产生不同程度的耐药性，而GA和BIO对犬猫皮肤病源分离菌株均有明显抑菌活性，显示其可作为潜在高效防控犬猫细菌性皮肤病的药物，为临床上犬猫细菌性皮肤病的治疗提供新思路。