基于网络药理学探讨中药复方治疗奶牛子宫内膜炎的作用机制

王钺夫，徐 闯，崔一喆

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆 163319）

奶牛子宫内膜炎（cow endometritis）是指以奶牛产后21～26 d奶牛子宫颈>7.5 cm或阴道内仍流出脓性液体甚至血液为主要特征的子宫黏膜炎症[1]。因子宫内膜炎导致不孕而淘汰的奶牛在所有奶牛淘汰原因中占比达1/3。子宫内膜炎在繁殖障碍性疾病中占比最大，危害最高。在现代临床兽医学上，奶牛子宫内膜炎主要由病原微生物感染导致[2]，在所有的患病奶牛中，以细菌侵入最为常见。致病菌主要为大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、变形杆菌及枯草芽孢杆菌等[3]。不同地区从患病奶牛体内分离出的致病菌和所占比率也不相同，但主要有大肠埃希菌、葡萄球菌、链球菌[4]。奶牛自身免疫机能下降及饲养环境污染都会造成致病菌大量繁殖，增加奶牛的发病几率。

目前，主要依靠抗生素治疗奶牛子宫内膜炎，且对发病奶牛有良好的治疗作用，但抗生素使用时间过长会导致致病菌产生耐药性，使用过于频繁会在奶牛体内造成残留，危害人体健康。近年来，中兽药治疗得到了广泛的重视，由于中药成分均来源于草本植物，避免了因抗生素频繁使用造成的耐药性增加及药物残留造成的危害，同时减少了治疗费用，成为了家畜疾病治疗研究的热点。

中兽医理论认为，奶牛子宫内膜炎属湿热带下性病征，湿邪侵入胞宫,致气血凝滞而发病[5]。在治疗时应以祛瘀、活血、解毒类药物为主[6]。丹参为寒凉性药物，具有祛瘀活血、通经止痛等功效，属于活血化瘀类药物，含有丹参酮Ⅰ、ⅡB、ⅡA和隐丹参酮等大量有效活性成分[7-9]，具有良好的抗菌消炎和抗癌功能，对微管的形成也有一定的抑制作用。益母草与丹参联用可增强活血化瘀作用[10]，促进子宫收缩，兽医临床上常用于促进产后恶露排出，对于产后引发的子宫炎症也有一定的效果。李健等[11]报道以丹参为主的中药复方制剂对奶牛子宫内膜炎有良好的治疗作用。黄芩、连翘为常见的清热解毒类药物，其中药复方——双黄连常用于治疗多种疾病引起的炎症[12]。本研究根据中药配伍原则，将丹参、益母草、连翘及黄芩组成中药复方，通过网络药理学分析该中药复方与奶牛子宫内膜炎之间的成分-靶点-通路是否存在关联，探究该中药复方是否对奶牛子宫内膜炎具有治疗作用，以期为奶牛子宫内膜炎网络药理学的药物靶点预测提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 药物活性成分靶点的筛选

通过TCMSP数据库（http:∥lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）对丹参、益母草、黄芩、连翘的活性成分靶点进行检索，药剂最终通过机体吸收入血，将口服利用度（OB）及类药相似度（DL）作为主要筛选条件，以OB值≥30%、DL>0.18为药物活性成分靶点的最低标准进行筛选[13]。

1.2 药物靶点蛋白与geneSymbol的转化

从Uniprot（https:∥www.uniprot.org/）网站上通过UniprotKB（蛋白数据库），以Bostaurus（普通牛）为物种检索已被Swiss-prot验证的蛋白数据，将药物的靶点蛋白与已验证的相关蛋白一一对应，并转换为相应的geneSymbol，将转换后靶点上传至Cytoscape 3.8.2软件绘制药物成分-靶点网络图。

1.3 奶牛子宫内膜炎靶点的筛选

通过NCBI的gene选项及GeneCard（https:∥www.genecards.org）、OMIM数据库（https:∥omim.org）、TTD（http:∥db.idrblab.net/ttd）、DrugBank（https:∥www.drugbank.com/）等网站将Bostaurus与endometritis（子宫内膜炎）作为检索项，获得与奶牛子宫内膜炎相关的基因靶点。

1.4 中药复方治疗奶牛子宫内膜炎靶点蛋白互作网络构建

将奶牛子宫内膜炎相关的疾病基因靶点与药物靶点蛋白进行交互，获得两者的交集靶点。将所得的交集靶点上传至STRING数据库（https:∥www.string-db.org/），建立预测中药复方治疗奶牛子宫内膜炎的靶点蛋白互作（PPI）网络，并通过Cystoscape 3.8.2软件对PPI网络进行整理筛选，通过Degree筛出核心靶点。

1.5 核心靶点网络富集分析

将预测药物-疾病靶点中的核心靶点上传至Metascape数据库（https:∥metascape.org）进行GO功能与KEGG通路富集分析，将得到GO功能与KEGG通路分析的主要通路上传至Cytoscape 3.8.2软件，制得靶点-通路网络图，并通过R语言根据P值制作主要靶点通路的气泡图。

2 结 果

2.1 药物活性成分靶点的筛选

从TCMSP数据库中筛出133个药物活性成分，其中丹参活性成分65个，以丹参酮（tanshinone）、紫草酸B（lithospermic acid B）、紫丹参萜醚（przewalskinb）等为主要成分（表1）；益母草活性成分9个，以槲皮素（quercetin）、山奈酚（kaempferol）、花生四烯酸（arachidonic acid）为主（表2）；连翘活性成分23个，以松脂酚（pinoresinol）、毛果芸香碱（（+）-pilocarpine）、连翘脂素（（-）-phillygenin）、连翘苷（phillyrin）为主，同时与益母草共有槲皮素与山奈酚（表3）；黄芩活性成分36个，以黄芩苷（baicalin）、黄芩素（baicalein）、汉黄芩素（wogonin）等黄酮类物质为主（表4），活性成分汉黄芩素、β-谷甾醇与连翘主要活性成分有交叉。

表1 丹参主要活性成分Table 1 Main active ingredients of Salvia miltiorrhiza

续表

表2 益母草主要活性成分Table 2 Main active ingredients of Leonurus heterophyllus

表3 连翘主要活性成分Table 3 Main active ingredients of Forsythia suspensa

表4 黄芩主要活性成分Table 4 Main active ingredients of Scutellaria baicalensis Georgi

2.2 药物活性成分-靶点网络

将所有药物活性成分于与Uniprot蛋白库进行比对，得到292个基因靶点，通过Cytoscape 3.8.2软件绘制成分-靶点网络图（图1），其中，药物成分山奈酚、汉黄芩素、丹参酮ⅡA、鼠尾草酚酮、金合欢素、花生四烯酸、紫丹参素B、紫丹参素E、二氢丹参酮Ⅰ、紫丹参萜醚的连接度（Degree）值均>30（表5），为该中药复方中的核心作用靶点化合物，所有基因靶点中前列腺素内过氧化物合酶2（PTGS2）、肾上腺素能受体（ADRA1A）、热休克蛋白90-1（HSP90-1）、PTGS1、钠离子通道α亚单位（SCN5A）、β2肾上腺素能受体（ADRB2）和核受体辅激活因子6（NCOA6）的Degree值均>50（表6），为药物活性成分的主要作用靶点。

图1 药物活性成分-靶点网络图Fig.1 Drug composition-target network diagram

表5 Degree>30的药物活性成分Table 5 Active ingredients with degree greater than 30

表6 Degree>50的基因靶点Table 6 Gene targets with degree greater than 50

2.3 中药复方治疗奶牛子宫内膜炎靶点蛋白的PPI网络构建

在NCBI、GeneCard、geneMap、TTD、DrugBank等网站获得奶牛子宫内膜炎相关基因靶点130个，与292个药物活性成分的基因靶点进行交互，并绘制Venn图，得到25个交集靶点（图2）。 通过Cytoscape 3.8.2软件构建药物-疾病靶点交互网络图（图3），得到25个预测药物作用于奶牛子宫内膜炎的交集靶点，将交集靶点上传至STRING网站，获得药物-疾病靶点的PPI网络图（图4），从图中可知PPI网络中包含24个节点，172条相互作用线，平均节点度为14.3，局部聚类系数为0.812。

图2 药物活性成分靶点与疾病靶点Venn图Fig.2 Venn diagram of drug component targets and disease targets

图3 药物-疾病靶点交互网络图Fig.3 Drug-disease target interaction network diagram

图4 预测药物-疾病靶点PPI网络图Fig.4 PPI network for predicting drug-disease targets

2.4 核心靶点的筛选

通过Cytoscape将PPI网络得到的结果根据Degree值大小对PPI网络中的预测药物作用于疾病的基因靶点进行筛选，Degree值越大靶点图标越大，颜色越深。由图5可知，肿瘤坏死因子（TNF）、蛋白激酶（AKT1）、PTGS2、CSC1样蛋白（CXCL8）、细胞肿瘤抗原p53（TP53）、白细胞介素1β（IL1β）和IL6 7个靶点的图标相对较大，颜色较深，可能为药物治疗奶牛子宫内膜炎作用的核心靶点。

2.5 靶点网络KEGG通路与GO功能富集分析

2.5.1 GO功能富集分析 将图5中的24个靶点上传至Metascape数据库进行GO功能富集分析，得到32个差异显著条目（P<0.01）,其中生物过程（biological processes，BP）20条，细胞组分（cellular components，CC）6个，分子功能（molecular functions，MF）6个（图6）。根据富集分数（enrichment score）大小对差异条目进行排列，富集分数越大，富集条目越显著。生物过程分析主要包括脂多糖的反应、白细胞-细胞黏附的正向调节、对无机物的反应、细胞对化学应激的反应、发热反应、对IL-1的反应、炎症反应的调节、对瘤坏死因子、蛋白质磷酸化的正向调控、白细胞与血管内皮细胞黏附的正向调节、僵化、腺体发育细胞因子介导的信号通路、组织重塑、生殖结构发育、消化系统发育、上皮细胞迁移的调节、对病毒的反应、核质转运的正向调节及干细胞分化的调控等；细胞组分分析显示靶点主要作用于细胞膜筏、薄膜侧面、颗粒分泌腔、细胞质核周区、转录调节复合物、胶原细胞外基质；分子功能分析得出，靶点功能主要涉及信号受体活性调节、转录辅激活子的结合、血红素结合、整合素结合、磷酸酶结合、蛋白质同二聚活性调节。

图5 根据Degree值构建的PPI网络图Fig.5 PPI network diagram based on degree value

图6 核心靶点GO功能富集分析Fig.6 GO function enrichment analysis of core target

2.5.2 KEGG通路富集分析 将核心靶点上传至Metascape数据库进行KEGG通路富集分析，得到9条差异显著条目（P<0.05）,结果显示，靶点主要涉及AGE-RAGE信号、癌症蛋白聚糖通路、血流剪切应力与动脉粥样硬化、麻疹、膀胱癌、Th17细胞分化通路、小细胞肺癌、白细胞跨内皮迁移及自然杀伤细胞介导的细胞毒性通路（图7）。根据通路-靶点网络图可知，AGE-RAGE信号通路、癌症蛋白聚糖通路、血流剪切应力与动脉粥样硬化通路及Th17细胞分化通路涉及基因数较多（图8）。

图7 核心靶点KEGG通路富集分析气泡图Fig.7 Bubble diagram of KEGG pathway enrichment analysis of core target

图8 KEGG通路富集分析基因通路-靶点网络图Fig.8 KEGG pathway enrichment analysis gene pathway-target network diagram

3 讨 论

奶牛子宫腔平时处于封闭状态，一般情况下没有外界病原微生物侵入，但在奶牛妊娠期间，尤其是分娩前后，子宫颈口开张，并持续排出恶露，此状态一直持续21 d左右，在此期间奶牛发生子宫内膜炎的风险提高，通常为细菌侵袭感染，细菌内毒素脂多糖通过与子宫内膜上皮Toll 样受体 4（Toll-like receptor 4,TLR4）结合，激活NF-κB信号通路，使p65和IκBα的磷酸化水平升高[14]，造成子宫内膜炎。感染后细菌毒素及炎性物质会影响卵泡发育和黄体的生成，从而对卵巢功能造成损害，使排卵期延后甚至停止[15]。中药复方中的丹参、黄芩等药物可抑制NF-κB的核移位及调控该通路的活化，降低p65和IκBα的磷酸化水平，有效颉颃脂多糖诱导的细胞炎症[16]。 证明该中药复方对奶牛子宫内膜炎引起的炎症症状具有缓解作用，从而达到治疗的作用。

通过网络药理学对中药复方药物成分进行解析，其中槲皮素、山奈酚、黄芩素、丹参酮ⅡA为主要作用成分。槲皮素与山奈酚大量存在于多种中药中，属于黄酮类化合物，是起治疗作用的主要成分之一，有抗菌、消炎、抗氧化等作用[17-18]。黄芩素为黄芩中的主要活性成分，经体外试验结果证明，其抑菌效果较为显著，对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌均有良好的抑菌作用[19]，丹参酮ⅡA大量存在于丹参中，具有抗炎、抗氧化作用，同时还对冠心病、脑血管疾病和心血管疾病具有改善作用[20]，该物质可通过Nrf2通路对高血压疾病进行自发性的缓解[21]，对炎症反应中造成的局部血压升高有良好的治疗作用。Fu等[22]报道，丹参酮ⅡA抑制环氧化酶-2和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的基因表达，降低脂多糖诱导的IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-8的表达。此外，丹参酮ⅡA抑制丙二醛水平，但可提高过氧化氢酶和超氧化物歧化酶的活性，通过试验证明，丹参酮ⅡA通过激活Nrf2信号通路表现出抗炎和抗氧化作用。本研究结果与以上结果基本一致，说明该中药复方的药物活性成分具有抗菌消炎等作用，从而达到治疗奶牛子宫内膜炎的目的。

这些中药活性成分主要作用于TNF、AKT1、CXCL8、TP53、IL-1β、IL-6等关键靶点蛋白。奶牛患有子宫内膜炎时TNF、IL-1β与IL-6表达水平均显著升高[23]，IL-1β与IL-6等促炎因子可通过自身影响细胞组织，使炎症的级联反应放大，引起巨噬细胞、肥大细胞、中性粒细胞、T细胞、B细胞等免疫细胞在炎症局部聚集，并释放炎症介质，加速炎症作用的发生[24]，CXCL8可促进炎症反应的发生，在与中性粒细胞接触后，会使中性粒细胞游走至作用部位，并释放可引发局部炎症反应的活性物质，同时发挥杀菌和损伤细胞的作用[25]；AKT1与TP53均参与细胞凋亡与葡萄糖代谢作用，影响细胞的增殖和生长。PTGS2可通过抑制环氧活酶（COX）活性来减少前列腺素的产生，从而减轻炎症作用，达到消炎镇痛的效果[26]。这些靶点蛋白均与炎症反应的发生有密切联系，因此本研究通过富集分析这些靶点蛋白的功能和通路来探讨中药复方治疗奶牛子宫内膜炎的作用机制。

根据Metascape数据库对该中药复方治疗奶牛子宫内膜炎的核心靶点进行KEGG通路富集分析。结果表明，癌症蛋白聚糖、血流剪切应力与动脉粥样硬化、麻疹、膀胱癌、Th17细胞分化通路、小细胞肺癌、白细胞跨内皮迁移及自然杀伤细胞介导的细胞毒性通路是该病的主要作用通路。AGE是在体内脂肪和糖类极高的环境下形成具有一定毒性的大分子化合物，与RAGE结合形成通路。通常该通路的发生与糖尿病等代谢机能障碍性疾病相关，但在该通路的作用下，组织活性氧自由基大量生成，使机体的抗氧化机制受到影响，多种细胞因子的释放，造成了炎症反应的发生，且AGE激活NF-κB通路的传导[27]，使p65与IκBα磷酸化，导致子宫内膜炎的发生，而丹参的单体成分可通抑制NF-κB通路的激活，减轻炎症反应[28]。大肠埃希菌感染子宫内膜后，内膜上皮组织分泌IL-1β、IL-6、TNF-α[29]等炎性因子对炎症起到了促进的作用，而IL-6的分泌与Th17细胞的分化有直接关系[30]，黄芩苷为该中药复方的主要成分之一，吴峰淼等[31]研究结果表明,黄芩苷改变对Th17与Treg细胞的免疫平衡，使JAK/STAT3的激活受到抑制，以减轻炎症反应。

4 结 论

由丹参、益母草、连翘及黄芩组成得中药复方治疗奶牛子宫内膜炎可能是通过槲皮素、山奈酚、黄芩素、丹参酮ⅡA等药物活性成分，作用于TNF、AKT1、PTGS2、CXCL8、TP53、IL-1β、IL-6等核心靶点，通过AGE-RAGE信号通路及Th17细胞的分化对奶牛子宫内膜炎产生治疗作用。该中药复方药物的治疗作用仍需进一步试验验证，本研究结果为今后的动物试验及相关临床研究提供了依据和参考。