头孢氨苄免疫层析表面增强拉曼光谱检测方法研究

2022-06-01邹明强齐小花李博逸

中国畜牧兽医 2022年4期

陈艳，薛强，金涌，邹明强，齐小花，李博逸，殷宏

（中国检验检疫科学研究院，北京 100123）

头孢氨苄（cephalexin）是一种β-内酰胺类抗生素，对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均有抗菌作用，广泛用于治疗奶牛的乳腺炎等疾病[1]。但由于使用方法不当或不遵守休药期等原因，易导致其在乳品中残留，从而危害人体健康，且长时间超剂量使用会导致细菌的耐药性[2]。针对该药物在食品中的残留，欧盟及中国均设定其在牛奶中的最高残留限量为100 ng/mL[3-4]。

目前，用于检测头孢氨苄的方法主要有高效液相色谱法[5-6]或色谱-质谱联用分析法[7]、荧光免疫层析法[8]、胶体金免疫层析法[9-10]等。色谱法或色谱-质谱等联用技术样品前处理操作繁琐、费用高，只有专业人员才能进行检测，不适用于大量样品的快速检测。免疫分析法主要有胶体金层析法、荧光免疫层析法、ELISA方法等，此类方法检测时间短，成本较低，适于现场监控和大规模样品筛选，但在灵敏度、广谱特异性或检测范围上会存在不足，检测灵敏度亟需提高。由于表面增强拉曼光谱技术（SERS）可检测低至单分子水平的目标物，是目前最灵敏的分析方法之一[11-12]，将免疫层析和表面增强拉曼光谱相结合的技术，近几年发展很快[13-14]。基于此，本研究制备了一种金银复合核壳结构的纳米贵金属，通过连接头孢氨苄抗体和拉曼信号分子，结合共聚焦拉曼光谱仪，开发快速、灵敏、操作简便的牛奶中头孢氨苄免疫层析表面增强拉曼光谱检测方法，以期解决当前头孢氨苄免疫检测灵敏度低的瓶颈性技术难题。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂头孢氨苄标准品（cephalexin，CEX）、头孢噻吩钠标准品、头孢曲松钠标准品、头孢克洛标准品、头孢夫辛酯标准品均购自Dr.E公司；头孢氨苄抗体（CEX-Ab）和头孢氨苄包被原（CEX-BSA）均由本实验室自制；NC膜（stedim UniSart CN140）购自Sartorius公司；样品垫（GFCP20300）和吸水纸（CFSP223000）均购自Millpore公司；PVC底板购自上海金标生物科技有限公司；高氯酸（HAuCl4,99%）、柠檬酸三钠（99.8%）、牛血清白蛋白（BSA,98%）和羊抗鼠IgG均购自Sigma公司；Tween-20购自北京化学试剂厂；5,5’-二硫代双2-硝基苯甲酸（5,5’-dithiobis-2-nitrob enzoic acid，DTNB）、Polyvinylpyrrolidone （PVP-K30，99%）、抗坏血酸（AA,99%）和硝酸银（AgNO3,99%）均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；超纯水（18.2 MΩ）购自Millpore公司。

1.1.2 主要仪器共聚焦拉曼光谱仪（Renishaw invia）购自Renishaw公司；喷膜仪（Biodot XYZ 3050）和切条机（Biodot CM4000）均购自Biodot公司；微波合成萃取仪（XH-100A）购自北京祥鹄科技有限公司；透射电子显微镜（JEM-2100）购自JEOL公司；双光束紫外分光光度计（U-3310）购自Hitachi Limited公司。

1.2 方法

1.2.1 纳米金的制备采用改良的柠檬酸三钠还原法制备胶体金（AuNPs）[15]。将1%的氯金酸溶液1 mL加入99 mL去离子水中在微波合成萃取仪中加热搅拌。温度上升至98 ℃时，迅速加入1%柠檬酸三钠溶液1.4 mL，继续加热搅拌，颜色呈酒红色后取出，冷却至室温。

1.2.2 金纳米粒子表面修饰 DTNB 参考Ni等[16]方法，将AuNPs与拉曼信号分子DTNB连接。取10 mL胶体金溶液加入0.01 mol/L的DTNB溶液20 μL，室温下搅拌反应2 h，12 000 r/min 离心10 min，去除上清液，沉淀用2 mL超纯水混悬，即得AuNPs-DTNB溶液。

1.2.3 银包裹AuNPs-DTNB核壳结构的制备取2 mL AuNPs-DTNB溶液和1 mL 1% PVP加入烧杯中室温搅拌5 min，随后加入2 mL 0.01 mol/L抗坏血酸并搅拌15 mim，在3种溶液混合的同时，逐滴加入0.01 mol/L AgNO3溶液0.6 mL，胶体颜色由酒红变成橙黄，再搅拌反应30 min，用超纯水洗涤2次，8 000 r/min离心10 min，沉淀用等体积的超纯水混悬，超声分散，即得金银核壳与拉曼信号分子DTNB偶联物（Au-DTNB@Ag），用透射电子显微镜和双光束紫外分光光度计对纳米金和修饰拉曼信号分子的金银复合核壳结构进行表征。

1.2.4 拉曼免疫探针制备

1.2.4.1 K2CO3添加量优化各取1 mL上述制备的Au-DTNB@Ag溶液，分别加入2、4、6、8和10 μL 0.05 mol/L的K2CO3溶液调pH，向溶液中加入4 μg CEX-Ab，搅拌反应30 min后，加入10% BSA溶液至终浓度为1%，搅拌反应30 min。4 ℃、10 000 r/min离心10 min，沉淀用保存液（即0.02 mol/L硼酸钠缓冲液,含2% BSA,0.25% Proclin-300，pH 7.4）混悬。通过免疫层析试纸条层析，观察检测线（T线）和质控线（C线）的颜色，确定制备拉曼免疫探针加入最佳K2CO3的量。

1.2.4.2 抗体量优化根据上述步骤确定的最佳K2CO3的量，各取1 mL Au-DTNB@Ag溶液，加入最佳K2CO3的量，调pH后，加入不同量的抗体（2、3、4和5 μg），搅拌反应30 min后，加入10% BSA溶液至终浓度为1%，搅拌反应30 min。4 ℃、10 000 r/min离心10 min，沉淀用保存液混悬。通过免疫层析试纸条层析，观察T线和C线的颜色，确定制备拉曼免疫探针的最佳抗体加入量。

1.2.5 基于SERS增强的免疫层析试纸条组装用0.02 mol/L PB稀释CEX-BSA和羊抗鼠IgG，通过Biodot XYZ 3050喷膜仪喷膜，将包被原和羊抗鼠IgG包被在NC膜上，形成间隔0.4 cm的T线和C线，37 ℃恒温恒湿烘箱烘2 h，干燥保存备用；样品垫用0.01 mol/L Tris溶液（含0.5% Tween-20，pH 8.0）浸泡后于37 ℃烘干。将样品垫、吸水垫分别粘贴在带NC膜的PVC背衬上，用切条机切成4 mm宽的条状，即制成试纸条，干燥保存备用。

1.2.6 SERS免疫层析试纸条检测原理样品中的头孢氨苄与T线上的包被抗原CEX-BSA竞争与拉曼免疫探针Au-DTNB@Ag-CEX Ab相结合。当样品中有头孢氨苄时，拉曼免疫探针上所连接的抗体与头孢氨苄结合，CEX-BSA不能与拉曼免疫探针结合，因此，T线将不出现红色条带，结果为阳性。当样品中没有头孢氨苄时，拉曼免疫探针在NC膜上层析后与T线上包被的CEX-BSA结合，T线出现红色条带，结果为阴性。通过共聚焦拉曼光谱仪测定T线上的探针信号，测定头孢氨苄的含量（图1）。

图1 SERS免疫层析试纸条检测原理Fig.1 Schematic principle of the SERS immunochromatographic strip

1.2.7 SERS免疫层析试纸条标准曲线的建立取空白牛奶样品，用3%的三氯乙酸按1∶1（V/V）处理，10 000 r/min离心15 min除去蛋白和脂肪，取中间层清液用0.01 mol/L PBS（pH 7.4）5倍稀释后，在稀释液中添加不同浓度的头孢氨苄标准品，终浓度分别为0、0.01、0.1、0.5和1 ng/mL。在96微孔板里滴加5 μL的Au-DTNB@Ag-CEX Ab，分别取100 μL上述溶液加入微孔板里混匀，插入头孢氨苄SERS的免疫层析试纸条，头孢氨苄奶样溶液连同Au-DTNB@Ag-CEX Ab由于毛细管作用在NC膜表面层析，NC膜上的T线和C线即会显色，通过共聚焦拉曼光谱仪检测T线拉曼信号分子DTNB的特征峰。以相对拉曼光强度为纵坐标，标准品浓度为横坐标，绘制头孢氨苄的标准抑制曲线。该方法的最低检测限为空白测定平均值加3倍标准偏差。

1.2.9 牛奶添加回收在空白牛奶样品中添加头孢氨苄标准品至终浓度分别为1、4和8 ng/mL。将牛奶和3%的三氯乙酸按1∶1（V/V）混合，4 ℃、10 000 r/min离心15 min后，除去蛋白和脂肪，中间层清液转移到干净的离心管中，用0.01 mol/L PBS（pH 7.4） 5倍稀释，取100 μL用头孢氨苄SERS免疫层析试纸条层析，然后用共聚焦拉曼光谱仪测定DTNB信号分子的特征峰。

2 结果

2.1 纳米金和修饰DTNB的金银复合核壳的表征

透射电子显微镜结果显示，纳米金粒子的尺寸为20 nm左右，金银复合核壳尺寸约30 nm，且粒子中心为黑色；紫外分光光度计扫描纳米金的最大吸收波长在520 nm附近，而金银复合核壳的最大吸收波长出现在420 nm附近，发生了迁移，说明银成功包裹在金表面。用共聚焦拉曼光谱仪检测纳米金和修饰DTNB的金银复合核壳，发现修饰DTNB的金银复合核壳出现拉曼信号，而未修饰DTNB的纳米金无拉曼信号（图2）。

A,纳米金透射电子显微镜观察（320 000×）；B,修饰DTNB的金银复合核壳透射电子显微镜观察（650 000×）；C,纳米金和修饰DTNB的金银复合核壳的紫外吸收光谱；D,纳米金和修饰DTNB金银复合核壳拉曼光谱A,TEM of AuNPs （320 000×）；B,TEM of Au-DTNB@Ag （650 000×）；C,Ultraviolet absorption spectra of AuNPs and Au-DTNB@Ag；D,Raman spectroscopy of AuNPs and Au-DTNB@Ag图2 纳米金和修饰DTNB的金银复合核壳的表征Fig.2 Characterization of AuNPs and Au-DTNB@Ag

2.2 拉曼免疫探针最佳K2CO3和最佳抗体量的优化

由图3A可知，随着K2CO3量的增加，层析试纸条上T、C线显色逐渐变深，当K2CO3加入量为6 μL时，层析试纸条上T、C线显色最深，再继续增加K2CO3的量，T、C线显色变浅，因此，最适的K2CO3使用量为6 μL。由图3B可知，随着头孢氨苄抗体量的增加，层析试纸条上T、C线显色逐渐变深，再继续增加抗体量，抗体结合逐渐饱和，T、C线显色不变，因此最适的抗体使用量为3 μg。

A,K2CO3添加的优化；B,抗体标记量的优化A,Optimization of K2CO3 addtion；B,Optimization of antibody labeling quantity图3 拉曼免疫探针制备反应条件的优化Fig.3 Optimization of reaction conditions for preparation of Raman immunoprobe

2.3 头孢氨苄标准曲线的建立

通过共聚焦拉曼光谱仪测定SERS免疫层析试纸条T线上的拉曼探针DTNB的拉曼光谱，DTNB的特征峰为1 062、1 154、1 334和1 558 cm-1，在1 334 cm-1处特征峰信号最强，选取此处峰高进行定量测定头孢氨苄的含量。以相对拉曼光强度为纵坐标，标准品浓度为横坐标，绘制头孢氨苄的标准抑制曲线（图4）。由图4A可知，随着牛奶样品中头孢氨苄含量的增加，检测线T线颜色逐渐变浅，肉眼观察头孢氨苄免疫层析试纸条的检测限为1 ng/mL，头孢氨苄的标准抑制曲线回归方程为y=-11 177.86 lg（x）+6 208.29，相关系数R2=0.98。根据空白测定平均值加3倍标准偏差，求得最低检测限为0.001 ng/mL,线性范围为0～1 ng/mL，50%抑制的质量浓度为0.05 ng/mL。

A,头孢氨苄SERS免疫层析试纸条；B,头孢氨苄SERS增强拉曼光谱图；C,头孢氨苄标准曲线A,Cephalexin SERS immunochromatographic strip；B,SERS enhanced Raman spectrogram of cephalexin；C,Standard curve of cephalexin图4 头孢氨苄标准曲线的建立Fig.4 Establishment of standard curve of cephalexin

2.4 交叉反应率

采用SERS的免疫层析试纸条对结构类似的头孢菌素类药物进行交叉反应性试验，结果显示，该试纸条与头孢克洛有交叉反应性，头孢克洛50%抑制浓度为0.045 ng/mL，交叉反应率为111.1%；与其他头孢菌素类药物无交叉反应性，交叉反应率均低于0.1%（表1）。表明本试验所建立的头孢氨苄SERS免疫层析检测方法对头孢氨苄和头孢克洛具有较高的特异性。

表1 头孢氨苄SERS免疫层析试纸条交叉反应性Table 1 Cross reactivity of cephalexin SERS immunochromatographic strips

2.5 牛奶添加回收

由表2可知，头孢氨苄的加标回收率范围为94.4%～103.3%，变异系数为2.5%～7.4%。这表明本试验建立的方法对于牛奶样品中头孢氨苄残留的检测有很好的适用性和准确度。

表2 SERS免疫层析试纸条测定牛奶加标回收率（n=4）Table 2 Determination of spiked milk recovery by SERS immunochromatographic strip （n=4）

3 讨论

早在1989年，Rohr等[17]研究发现，将固相抗体和拉曼增强试剂标记过的抗体通过目标物相连，形成“三明治”夹心复合物，通过测定标记抗体的SERS信号进行目标物的检测。随着研究的不断深入，表面增强拉曼光谱结合免疫分析技术进入了快速发展时期，近几年发展成为分析化学领域的研究热点之一。

将表面增强拉曼光谱与免疫分析技术进行结合建立的SERS免疫层析检测技术，不仅具有SERS的高灵敏性和光谱可区分性，还具有免疫分析的高特异性和便捷性[18-20]。表面增强拉曼光谱免疫分析技术的关键点是拉曼免疫探针的制备，这就需要进行探针材料和拉曼信号分子的选择。Wang等[21]利用银包裹金核壳作为拉曼探针材料，修饰拉曼信号分子4-巯基苯甲酸（4-mercaptobenzoic acid，MBA）和双酚A抗体，合成拉曼免疫探针，开发了水中双酚A的检测方法。Shi等[22]利用金纳米粒子作为探针材料，选用同一种拉曼信号分子4-氨基苯硫酚（4-aminothiophenol，PATP），分别与新霉素抗体和喹诺酮类抗体结合，合成新霉素拉曼免疫探针和喹诺酮类拉曼免疫探针，开发了牛奶种同时检测2种抗菌药的方法。Wang等[23]利用银包裹金作为探针材料，修饰拉曼信号分子4-硝基苯硫酚（4-nitrothiophenol，4-NTP）和葡萄球菌肠毒素B抗体，合成拉曼免疫探针，开发了牛奶中检测葡萄球菌肠毒素B的方法。Wang等[24]利用二氧化硅包裹金核壳作为探针材料，修饰拉曼信号分子DTNB和白细胞介素6（IL-6）抗体，合成拉曼免疫探针，开发了检测全血中的IL-6的高灵敏检测方法。综上所述，拉曼探针材料和拉曼信号分子的选择具有多样性，若同时进行多个目标物的检测可选择多种拉曼信号分子合成多种拉曼免疫探针，也可通过试纸条包被多个目标物来实现多残留检测。这种表面增强拉曼光谱与免疫分析技术相结合的技术极大地提高了待测目标物的灵敏度，且具有较强的特异性，多目标物同时检测不但节省了时间，还降低了检测的成本。

本研究选择制作简便、成本低的金、银2种贵金属作为拉曼探针材料，拉曼信号分子选择DTNB。利用银包裹金核壳结构作为SERS探针材料，既具有金纳米粒子的稳定性，又具有银纳米粒子的拉曼增强效果。在金银核壳表面修饰拉曼信号分子DTNB和头孢氨苄抗体，将表面增强拉曼光谱技术与免疫层析技术相结合，开发了一种超灵敏的头孢氨苄表面增强拉曼光谱免疫层析检测技术，这种方法的线性检测范围为0～1 ng/mL，检测限为0.001 ng/mL。胡佳丽等[25]建立荧光免疫层析法快速测定牛奶中头孢氨苄残留量，检测限为0.16 ng/mL。 Bian等[26]制备了头孢氨苄单克隆抗体，建立了牛奶等样品中头孢氨苄免疫荧光检测方法的检测限为0.1 ng/mL。Li等[27]结合免疫磁珠分离技术建立的头孢氨苄荧光检测技术的检测限为0.34 ng/mL。本研究获得头孢氨苄的检测限为0.001 ng/mL，具有更高的灵敏度。

样品基质里含有的蛋白质和脂肪会影响免疫分析试验中抗原-抗体的结合，会降低免疫竞争反应的敏感性和可靠性。因此，可通过对样品进行适当稀释或适当的净化步骤消除基质干扰。本试验绘制的标准曲线是将药物加入牛奶中，再用3%的三氯乙酸处理，离心去除蛋白和脂肪，最后用PBS稀释5倍，基本消除基质的干扰，样品测定也以相同的反应介质，这样能减少基质干扰带来的试验误差，对于牛奶样品仅需简单的前处理去除蛋白和脂肪即可用于检测。