H9N2亚型禽流感病毒SD18株的传染性及不同途径感染效果比较

2022-06-01侯晓红龙宪荣赵孝民戴培强柴同杰

中国畜牧兽医 2022年4期

侯晓红，王蒙，武博，龙宪荣，赵孝民，高静，戴培强，柴同杰

（1.山东农业大学动物科技学院，泰安 271000；2.泰安市中心医院，泰安 271000；3.泰安市泰山区中科生物研究所，泰安 271000）

H9N2亚型禽流感病毒（Avian infuenza virus，AIV）于1966年在美国首次发现，属于低致病性禽流感病毒，致死率较低。但当其与其他病原体混合感染时，会导致家禽发病率和死亡率大幅度升高[1-2]。Bi等[3]研究表明,从2016年开始，中国家禽群中H9N2亚型AIV已成为鸡群和鸭群中的优势流感病毒亚型。目前，H9N2亚型AIV已可突破种间屏障，感染猪、犬、水貂、蝙蝠及人等哺乳动物[4-7]。

2009-2013年，中国出现了许多包含H9N2原始基因的新亚型AIV，如H7N9和H10N8亚型AIV等[8-9]。2005-2011年，报告了4例人类感染病例，而在2012-2019年，人类感染H9N2亚型AIV的病例已增加到28起，说明H9N2亚型AIV的跨种传播能力正在慢慢发生改变[10]。Sang等[11]研究发现，2010年分离的2株病毒虽具有与α-2,6-唾液酸受体结合的能力，但病毒在感染豚鼠中不能通过直接接触传播。Chen等[12]研究了2016-2019年间从家禽体内分离到的21株H9N2亚型AIV在哺乳动物中的适应性，发现约有50%的毒株可在小鼠肺脏中良好复制。这说明H9N2亚型AIV的致病性、宿主范围及传染方式正在发生变化，部分H9N2亚型AIV毒株已可感染哺乳动物并使其产生临床症状。因此，本研究首先在养鸡场采集病料分离H9N2亚型AIV，对分离鉴定的H9N2亚型AIV进行豚鼠致病性及气溶胶感染试验来验证H9N2亚型AIV的致病性及传播方式的变化，这对评估流感大流行趋势及对公共卫生的危害风险，进而制定有效的防控措施具有重要的指导意义。

目前研究主要针对H9N2亚型AIV对人肺上皮细胞的致病机理，对AIV感染支气管上皮细胞研究较少[13-14]。本研究将分离到的H9N2亚型AIV感染人支气管上皮细胞后检测病毒在人支气管上皮细胞上的复制能力及诱导的细胞因子表达情况，从而有利于加深对人类支气管上皮细胞中H9N2亚型AIV致病机理的研究。

1 材料与方法

1.1 试验动物、细胞及病料

4周龄SPF清洁级Hartley雌性豚鼠购自山东省青岛市康大生物科技有限公司；9日龄SPF鸡胚购自山东省农业科学院家禽研究所。犬肾细胞系（MDCK，BNCC239717）、人支气管上皮细胞（BEAS-2B，CRL-9609）均由山东农业大学环境微生物实验室保存。病料（肺脏、肝脏、肛拭子等）于2018年采集于山东部分规模化养鸡场，均由山东农业大学环境微生物实验室保存。所有动物试验均按照山东农业大学动物福利和使用委员会（SDAUA-2016-004）的指导进行。

1.2 主要试剂及仪器

FastPure Viral DNA/RNA Mini Kit、HiScript®Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR （+gDNA wiper）逆转录试剂盒、AceQ®Universal U+ Probe Master Mix V2探针法荧光定量试剂盒、FastPure®Cell/Tissue Total RNA Isolation Kit V2均购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；Toll样受体3（TLR3）、TLR7、抗黏病毒蛋白（MX）、2′,5′-腺苷酸激酶（OAS） ELISA检测试剂盒均购自上海酶联生物科技有限公司；TPCK-胰酶购自Sigma公司；PBS缓冲液、4%组织细胞固定液均购自北京索莱宝科技有限公司；0.25% EDTA胰酶、DMEM培养基、胎牛血清均购自Gibco公司；A型流感病毒HA鼠单克隆抗体购自Cell Signaling Technology公司；FITC标记的山羊抗小鼠IgG抗体购自北京全式金生物技术有限公司；免疫染色一抗、二抗稀释液购自碧云天生物科技有限公司。

超高速离心机（CP100WX）购自日立公司；豚鼠肺部液体定量雾化器（HRH-MAG4）购自北京慧荣和科技有限公司；清洁级鼠隔离器（1 000 mm×600 mm×900 mm）（PR-22）购自苏州市冯氏实验动物设备有限公司；荧光定量7500 Real-time PCR仪（4351104）购自ABI公司；酶标仪（Thermo K3）购自Thermo公司；荧光显微镜（Ti2-U）购自日本尼康公司；空气样品收集器AGI-30（ZR-B01）购自青岛众瑞智能仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 引物设计与合成依据GenBank中相关基因序列信息，利用Primer Premier 5.0软件设计试验所需引物，引物信息见表1。引物均由北京擎科生物科技有限公司合成。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.3.2 病毒分离鉴定及生物学特性研究将采集的病料进行研磨过滤后接种9日龄SPF鸡胚进行分离纯化病毒，通过血凝及血凝抑制（HA-HI）试验、反转录PCR（RT-PCR）对病毒亚型进行鉴定。PCR产物送青岛擎科公司进行测序。

接种病毒的9日龄SPF鸡胚37 ℃温箱内孵育72 h后无菌收取鸡胚尿囊液，于-80 ℃保存，通过Reed-Muench法计算病毒的鸡胚半数感染量（50% egg infectious dose，EID50）[15]。将长势良好的MDCK细胞接种至96孔细胞板，待细胞汇合度达到80%左右时将病毒液按10-1至10-9倍比稀释后接种到细胞板中，于37 ℃、5% CO2培养箱中孵育2 h，弃掉细胞板中的病毒液，加入维持液继续在CO2培养箱中培养，观察细胞病变，根据公式计算半数组织培养感染量（50% tissue culture infective dose，TCID50）[15]。

将病毒液以300 μL/只（107EID50）的剂量经滴鼻途径接种5只豚鼠，在接种后的第6天取豚鼠脾脏、气管、肺脏、肾脏组织进行研磨离心后取上清液，上清液经过滤后按照10-1至10-9倍比稀释接种至SPF鸡胚中，收集尿囊液根据Reed-Muench法测定各组织的病毒滴度。

1.3.3 SPF豚鼠感染试验将豚鼠随机分为3组:滴鼻组、肺递送组和对照组，每组各15只。滴鼻组将豚鼠用干冰麻醉后通过滴鼻途径接种H9N2亚型AIV，接种剂量为300 μL/只（107EID50）；肺递送组采用肺部液体定量雾化器接种豚鼠，接种剂量为300 μL/只（107EID50）;对照组通过滴鼻途径接种等量无菌PBS。在攻毒后第3、6、9、12、15天，每组分别随机取3只豚鼠，采集豚鼠口腔和肛门棉拭子，根据FastPure Viral DNA/RNA Mini Kit操作说明提取棉拭子RNA，并根据HiScript®Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR （+gDNA wiper）试剂盒操作说明将RNA反转为cDNA。通过探针法实时荧光定量PCR对排毒开始和终止时间及排毒量进行检测，引物信息见表1。反应体系20 μL：AceQ®Universal U+ Probe Master Mix V 10 μL，上、下游引物各0.4 μL，cDNA 1 μL，TaqMan Probe 0.2 μL,ddH2O 8 μL。反应条件：37 ℃反应2 min；95 ℃预变性5 min；95 ℃变性10 s，60 ℃退火延伸10 s，共45个循环。利用建立好的H9标准曲线方程（y=-3.117x+38.4971）测定病毒的拷贝数[16]。按照ELISA试剂盒检测分离株感染豚鼠后肺脏组织中先天性免疫应答相关蛋白TLR3、TLR7、MX、OAS的表达水平。采集豚鼠全血，离心后收集血清，参照OIE（2008）标准进行HA-HI试验，测定豚鼠血清中抗体效价。

1.3.4 H9N2亚型AIV在豚鼠间的气溶胶发生、传播与感染试验 SPF豚鼠放置在2个正负压隔离器A、B中，2个隔离器间用长180 cm、直径8 cm的密闭管连接，外界空气经HEPA滤膜进入隔离器A，再经密闭塑胶管流到隔离器B中，对从隔离器B排出的气体经过消毒过滤处理，风速为0.05～0.2 m/s，温度为20～24 ℃、湿度为40%～60%。试验动物分为4组：接种组、直接接触组、飞沫组和气溶胶感染组。在隔离器A中饲养21只SPF豚鼠：其中接种组7只豚鼠经麻醉后鼻腔内接种300 μL病毒液（107EID50）；在接种24 h后，将剩余14只豚鼠放入隔离器A中，其中7只豚鼠为直接接触组，另外7只为飞沫传播组。直接接触组和接种组在一个笼子里，飞沫传播组在另一个笼子内，2个笼子距离相隔约为20 cm。在隔离器B中，放入10只SPF豚鼠，为气溶胶感染组。严格按照清洁级豚鼠的饲养标准进行饲养。

在豚鼠接种病毒第2、4、6、8、10、12、14、16天，每组分别采集7只豚鼠的鼻洗液样品，将过滤好的鼻洗液接种于3枚9日龄SPF鸡胚，孵化器内37 ℃恒温孵育，无菌收取24～72 h的鸡胚尿囊液，用HA试验鉴定豚鼠排毒情况。在豚鼠接种病毒后第3、6、9、12、15天，用空气样品收集器AGI-30（All Glass Impinger）收集2个隔离器内的空气样品，收集时间为30 min，AGI-30的流量调节为12.5 L/min，样品收集介质为25 mL含有10%青链霉素的无菌PBS。将采集液经4 ℃、10 000×g离心70 min后取上清液，弃去沉淀除掉细菌和尘埃，将上清液再经4 ℃、100 000×g离心120 min以获得病毒粒子沉淀，用700 μL灭菌PBS将病毒粒子沉淀重悬。提取病毒的RNA，进行探针法实时荧光定量PCR检测豚鼠排毒情况，引物信息见表1。在接种感染后的第0、7、14、21天每组取3只豚鼠经心脏采血离心后收集血清，参照OIE（2008）标准进行HA-HI试验,测定抗体效价。

1.3.5 H9N2亚型AIV感染BEAS-2B细胞将长势良好的BEAS-2B细胞接种于24孔细胞培养板中，待细胞汇合度达到80%左右时以感染复数（MOI）为0.1的量接种病毒，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养2 h后弃去病毒液,加入含有1%胎牛血清的细胞维持液，在攻毒后12、24和36 h进行间接免疫荧光试验。将24孔细胞培养板中细胞维持液弃掉，用PBS洗涤后每孔加入200 μL 4%组织细胞固定液，室温固定10 min后用PBS冲洗。使用0.1% Tritonx-100通透细胞，室温下静置10 min后弃去，并用PBS洗涤。在每孔中依次加入200 μL稀释好的HA鼠单克隆抗体，于37 ℃恒温箱中孵育60 min，随后用PBS洗涤细胞培养板，每孔依次加入200 μL稀释好的FITC标记的山羊抗小鼠IgG二抗，于37 ℃恒温箱中避光孵育45 min，加入适量的PBS洗涤细胞培养板后通过荧光显微镜观察结果。

将BEAS-2B细胞接种于6孔细胞培养板中，每孔加入稀释好的病毒液0.5 mL以及1.5 mL无血清的DMEM原液，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养2 h后弃掉病毒液并加入2 mL细胞维持液。在攻毒后的6、12、18、24和36 h 5个时间点收取细胞进行实时荧光定量PCR测定相关细胞因子表达情况，以GAPDH为内参基因，采用2-ΔΔCt法计算TLR3、TLR7、MX、OAS、白介素-6（IL-6）、IL-8和干扰素-β（IFN-β）基因的相对表达量。

1.4 数据统计分析

试验结果均以平均值±标准差表示，并使用GraphPadPrism 6.0可视化。使用SPSS 19.0软件进行t检验。P<0.05表示差异显著;P<0.01表示差异极显著。

2 结果

2.1 H9N2亚型AIV的鉴定及生物学特性研究

由图1可知，对分离株进行PCR扩增，PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳验证，H9为383 bp，N2为281 bp，扩增条带大小位置与预期相符，通过胶回收将目的片段测序，结果显示为H9N2亚型AIV，将该株病毒命名为A/Chicken/Shandong/07/2018（缩写为SD18）。

M，DL2000 DNA Marker；1，H9目的片段；2，N2目的片段；3，阴性对照M,DL2000 DNA Marker,1,H9 target fragment,2,N2 target fragment,3,Negative control图1 SD18株PCR产物扩增电泳图Fig.1 Electrophoretogram of PCR amplification products of SD18 strain

SD18株接种鸡胚及MDCK细胞后，将收获的病毒液进行HA-HI检测。根据Reed-Muench法计算病毒的EID50为10-8.68/0.2 mL，TCID50为10-6.69/0.1 mL。

SD18株感染豚鼠6 d后可在豚鼠的气管和肺脏组织中检测到病毒，病毒滴度分别为4.30 lg EID50/g、4.75 lg EID50/g，差异不显著（P<0.05）（图2）。

ND,无数据。下同ND,No data.The same as below图2 攻毒后第6天豚鼠各组织病毒滴度检测结果Fig.2 Results of virus titer detection in guinea pig tissues on the 6th day after infection

2.2 SPF豚鼠感染效果

2.2.1 排毒情况在整个试验周期过程中，SPF豚鼠未出现死亡情况，但出现体重减轻，食欲减退等临床症状。由图3A可知，滴鼻组豚鼠的咽拭子和肺递送组的排毒规律基本相同，在接种病毒后第3天，均可在体内增殖复制且检测到病毒，且排毒量最高，病毒拷贝数均为103.56拷贝/μg。由图3B中可知，2组豚鼠的肛拭子排毒趋势也基本相同。在整个排毒过程中，肺递送组豚鼠的咽拭子和肛拭子排毒量均高于滴鼻组。

①A，咽拭子；B，肛拭子。②同一时间点，*,差异显著（P<0.05）；**,差异极显著（P<0.01）；无*,差异不显著（P>0.05）。下同①A，Throat swab;B，Anal swab.②At the same time point,*,Significant difference （P<0.05）;**,Extremely significant difference （P<0.01）；No *,No significant difference （P>0.05）.The same as below图3 豚鼠排毒情况Fig.3 Virus excretion of guinea pigs

2.2.2 豚鼠肺脏组织的抗病毒蛋白及受体的表达 SD18株病毒感染SPF豚鼠的3～9 d内，滴鼻组和肺递送组的TLR3、TLR7受体含量均显著或极显著高于对照组（P<0.05；P<0.01）。2组豚鼠肺脏中TLR3受体的含量都在第6天达到高峰，TLR7受体的含量在第3天上调至最高，但肺递送组诱导的TLR3和TLR7受体的含量与滴鼻组差异不显著（P>0.05）（图4A、4B）。在感染后3～15 d内，2组诱导的抗病毒蛋白MX、OAS的表达量均上调，在第9天上调至最大倍数，与对照组相比差异极显著（P<0.01），随后上调幅度降低。在第15天，肺递送组MX表达量与滴鼻组相比显著增加（P<0.05）（图4C、4D）。

图4 肺脏组织模式识别受体及抗病毒蛋白表达情况Fig.4 Expression of pattern recognition receptor and antiviral protein in lung tissue

2.2.3 豚鼠血清AIV抗体检测结果接种病毒前在豚鼠体内未检测到AIV抗体，在攻毒后第6天滴鼻组和肺递送组都可检测到AIV抗体存在，且抗体水平呈上升趋势，且肺递送组豚鼠比滴鼻组豚鼠产生的抗体水平高，攻毒后第6和15天2组豚鼠抗体效价差异显著（P<0.05）。

图5 豚鼠抗体水平检测Fig.5 Results of antibody detection in guinea pig

2.3 H9N2亚型AIV气溶胶发生、传播与传染验证

2.3.1 排毒检测结果由表2可知，在接种病毒后第2天，各试验组均未检测到排毒，从第4天开始，接种组和直接接触组的豚鼠鼻洗液中可检测到病毒存在，病毒分离率分别为57.14%和28.57%（表2），在第8天，接种组和直接接触组都达到排毒高峰期，分离率为100%，排毒时间一直持续到第16天；飞沫传播组从第6天开始可检测到排毒，分离率为42.86%，在第10天，飞沫传播组达到排毒高峰期；气溶胶感染组在整个试验周期中均未能从豚鼠鼻洗液中检测到病毒存在。

表2 SD18株感染豚鼠排毒检测结果Table 2 Results of detection virus excretion after SD18 strain inoculated guinea pigs %

2.3.2 流感病毒气溶胶检测结果在豚鼠接种病毒后3～15 d内，在隔离器的空气中均未能检测到病毒，尚未确认该株病毒的气溶胶传染。

2.3.3 血清抗体水平检测结果 SD18株感染豚鼠后，在7～21 d，接种组、直接接触组和飞沫传播组都可检测到AIV抗体存在，说明SD18株可在豚鼠间通过直接接触和飞沫传播的方式传播病毒并感染豚鼠使其产生抗体（图6）。

图6 SD18株感染豚鼠后血清抗体检测结果Fig.6 Results of antibody titer of guinea pigs after inoculated with SD18 strain

2.4 H9N2亚型AIV感染BEAS-2B细胞效果

2.4.1 H9N2亚型AIV在BEAS-2B细胞的增殖 BEAS-2B细胞接种病毒后在荧光显微镜下观察，12 h时能检测到病毒，视野下有少量细胞呈现荧光（图7B），24 h时视野下荧光增多，且荧光强度达到最强（图7C），到36 h时呈现下降趋势（图7D）。

A,阴性对照：B～D,BEAS-2B细胞感染SD18株后12、24 和36 hA,Negative control;B-D,BEAS-2B cells infected with SD18 strain for 12,24 and 36 h,respectively图7 BEAS-2B细胞感染SD18株后间接免疫荧光检测结果（200×）Fig.7 Indirect immunofluorescence assay result of BEAS-2B cells infected with SD18 strain （200×）

2.4.2 BEAS-2B感染后相关免疫因子及受体表达 SD18株感染BEAS-2B细胞后，与对照组相比，TLR3和TLR7基因表达量在整个过程中均极显著上调（P<0.01），且分别在24和36 h达到高峰（图8A、8B）。抗病毒蛋白MX和OAS基因表达量在整个过程中均极显著上调（P<0.01），且分别在36和24 h时达到高峰（图8F、8G）。炎性细胞因子IL-6、IL-8和IFN-β基因表达量也出现了不同程度的上调，其中IL-6和IL-8基因表达量在36 h时均极显著上调（P<0.01，图8C、8D）；IFN-β基因表达量在24 h时达到高峰（P<0.01，图8E）。

图8 SD18株感染BEAS-2B细胞后细胞因子表达情况Fig.8 Expression of cytokines in BEAS-2B cells infected with SD18 strain

3 讨论

近年来，H9N2亚型AIV已在全球范围内从不同种类的畜禽中分离出来[17-18]。H9N2亚型AIV最初出现在亚洲，随后非洲、欧洲和美国等地也开始出现，造成了重大的经济损失[19-21]。Peacock等[22]个别分支的H9N2亚型AIV已具有感染人类的能力，这对全球家禽业生产及人类健康构成了威胁。研究表明，源自哺乳动物的H9N2亚型AIV对小鼠毒性更高，且可在小鼠全身复制并具有神经毒性[23-24]。对山东省从事家禽养殖业的工人进行H9N2亚型AIV抗体检测发现约有2.3%的家禽养殖从业者血清抗体呈阳性[25]。因此，必须注意H9N2亚型AIV在哺乳动物中的适应性进化。Lina等[26]用2017年分离出的H9N2亚型AIV进行豚鼠试验发现,其可感染豚鼠，但感染的豚鼠不能通过直接接触传播病毒。本研究结果表明,SD18株不仅可通过直接接触感染豚鼠，而且还可通过飞沫传播感染豚鼠。这说明H9N2亚型AIV的跨种传播能力正在变强。

本研究发现，肺递送攻毒方式感染的豚鼠比滴鼻方式感染的豚鼠排毒量、抗体水平及抗病毒蛋白表达量更高，肺递送仪器依靠递送管和喷雾装置可直接插入到动物气管内部再发生气溶胶，其真实模拟了日常的吸入状态，产生的病毒气溶胶可到达肺部深处，导致肺部大量免疫细胞的驱化、聚集，甚至形成“细胞风暴”，使宿主产生严重的炎症反应，这表明病毒气溶胶对机体产生的危害更大，可导致机体产生强烈的免疫应答来抵抗病毒。近年来，已有研究证明TLR7受体可识别病毒的单链RNA（ssRNA），其中包括对甲型流感病毒的识别，因此，TLR7在诱导针对RNA病毒的抗病毒应答中起着重要作用[27]。而TLR3在识别病毒的双链RNA（dsRNA）后，可激活干扰素调节因子3（IRF3）和核因子-κB（NF-κB）的信号传导，启动先天免疫应答反应，抵御病原体的侵入[28]。除此之外，本研究还发现感染SD18株后豚鼠肺部抗病毒蛋白MX、OAS表达显著增高，并持续表达约2周。OAS是由干扰素诱导产生的抗病毒蛋白，在哺乳动物的抗病毒机制中起着重要作用[29]。病毒侵入机体后，OAS可诱导病毒RNA在受感染的细胞内衰变，从而有效抑制病毒的进一步复制[30]。由Ⅰ型干扰素诱导产生的抗黏病毒蛋白MX是一种功能强大的抗病毒蛋白，它可抑制正黏病毒的复制[31]。MX蛋白是已知的细胞内阻止甲型流感病毒复制的因子，其可保护哺乳动物免受流感病毒侵袭，还为抵抗流感病毒的跨种传播提供了强大的屏障[32]。因此，豚鼠肺部抗病毒蛋白及受体表达量的变化说明豚鼠先天性免疫系统被激活并发挥抗感染的作用。

流感病毒主要通过与污染物的直接接触、消化道及气溶胶进行传播，其中病毒气溶胶可在空气中悬浮较长时间并能进入呼吸器官的深部，传播快、距离远，这使得控制更加困难。研究表明，流感病毒的气溶胶传播是人与人之间传播的一种主要方式[33]。流感病毒颗粒可在气溶胶内保持传染性，并可在房间内传播[34]。Blachere等[35]在医院的急诊科检测出空气中存在流感病毒RNA。有许多指标表明，H9N2亚型AIV可能直接或间接地参与下一次流感大流行的发生[36]。本研究结果表明，H9N2亚型AIV SD18株接种豚鼠后能使豚鼠感染，在豚鼠的肺脏组织和气管内可检测到病毒复制，且肺脏组织内病毒滴度更高。SD18株还可通过直接接触和飞沫传播的方式感染豚鼠，致使豚鼠排毒并产生获得性免疫反应。本研究通过对直接接触组和飞沫传播组进行比较分析发现，直接接触组的豚鼠比飞沫传播组的豚鼠排毒时间更早、抗体水平更高，这说明与患病动物直接接触时病毒传播速度最快，风险最大，飞沫传染的发生是由其距离和病毒含量决定的。隔离器B中的气溶胶感染组豚鼠体内既未排毒也未产生抗体，在隔离器中也没有检测到病毒气溶胶，这说明未发生SD18株AIV气溶胶的形成，即豚鼠间的气溶胶传染未能获得验证。以上结果表明，SD18株可通过直接接触和飞沫传播的方式传播病毒感染豚鼠，但目前还不具备通过气溶胶传播病毒感染豚鼠的能力。

由于人呼吸道上皮细胞中存在α-2,6或α-2,3唾液酸受体，所以流感病毒更易与上皮细胞结合[37-39]。Xing等[40]研究表明，TLR3、TLR7是在H9N2亚型AIV感染原代人支气管上皮细胞后诱导的主要受体。SD18株感染BEAS-2B细胞后的12 h时能检测到病毒，在24 h时病毒在细胞内复制能力最强。相关的免疫因子与对照组相比显著上调，这表明SD18株可在人支气管上皮细胞中复制并诱导其免疫因子高水平表达，从而调节免疫反应。本研究分离到的SD18株AIV无需提前适应就可感染豚鼠并使其排毒及产生免疫反应，且还可通过直接接触及飞沫传播感染豚鼠并使其产生抗体。这表明近年来H9N2亚型AIV的致病性及跨种传播能力正在慢慢变强。提示应加强对H9N2亚型AIV致病性、传播能力及在哺乳动物上的适应性进化的研究，有助于尽早对H9N2亚型AIV可能带来的危害风险进行防控，防止出现重大损失。