黄连对溃疡性结肠炎小鼠肠道内嗜黏蛋白益生菌A.muciniphila菌及肠粘膜屏障的影响

杨光勇　喻良锦　涂小华　何亚敏　游丰锋　何光志

【摘 要】 目的：通過ERIC-PCR和半定量PCR技术检测黄连对溃疡性结肠炎（UC）小鼠肠道内菌群及嗜黏蛋白益生菌（A.muciniphila）菌的变化对肠粘膜屏障的影响。方法：葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导制备UC小鼠模型，分别为空白对照组，模型组，美沙拉嗪组（65 mg/kg， tid），黄连组（0.3 g/kg， qd）。造模成功后给予相应的药物或蒸馏水，连续给药10 d。实验第18天，收集小鼠新鲜粪便，用粪便基因组DNA试剂盒提取DNA，设计用ERIC-PCR及A.muciniphila细菌基因特异性引物，用ERIC-PCR方法检测粪便中菌群多样性，半定量PCR以反映各组A.muciniphila细菌变化，病理切片HE染色检测各组肠道组织变化。结果：ERIC-PCR结果显示，与正常组相比，模型组条带数量没有明显减少，但是条带位置变化较明显，黄连组带数量明显减少，但相比美沙拉嗪组多，肠道菌群的多样性提高;半定量PCR结果显示，与正常组相比，模型组条带稍明显，美沙拉嗪组稍暗，黄连组亮度明显升高，即A.muciniphila丰度升高;病理组织切片结果显示，与正常组相比，模型组肠道组织隐窝和腺体的正常结构被破坏，观察发现大量炎性细胞浸润到黏膜层，与模型组相比，美沙拉嗪组和黄连组的黏膜损伤程度小，腺体结构破坏较轻，炎性细胞的数量和浸润深度都显著减少。结论：黄连可调节DSS诱导的UC模型小鼠肠道菌群组成，提高A.muciniphila菌群丰度，可改善UC模型小鼠炎症。

【关键词】 黄连;溃疡性结肠炎;ERIC-PCR;半定量PCR;嗜黏蛋白益生菌

【中图分类号】R285.5【文献标志码】 A  【文章编号】1007-8517（2022）05-0027-06

基金项目：国家自然科学基金项目（81760864）;贵州省教育厅创新群体重大研究项目（黔教合KY字[2016]036）;贵州中医药大学项目（黔科合平台人才[2018]5766号-16）;贵州省科技科学技术基金（黔科合基础[2020]1Y392）;贵州省教育厅青年科技人才成长项目（黔教合KY字[2017]173）;贵州中医药大学大学生创新创业项目（贵中医大创合字[2019]57号）;贵州中医药大学院内科研项目（贵中医科院内[2018]49号）。

作者简介：杨光勇（1988- ），男，硕士，实验师，研究方向为中医药对肠道菌群及肠道免疫的影响。Email：768305874@qq.com

通信作者：何光志（1977- ），男，博士，教授，硕士生导师，研究方向为中西医结合基础研究。E-mail： 39272454@qq.com

Effect of Coptis Chinensis on Mucinophilic Probiotics A.muciniphila and Intestinal Mucosal

Barrier in Mice With Ulcerative Colitis

YANG Guangyong YU Liangjin TU Xiaohua HE Yamin YOU Fengfeng HE Guangzhi*

Guizhou University of Traditional Chinese Medicine，Guiyang 550025，China

Abstract：Objective ERIC-PCR and semi quantitative PCR were used to detect the effect of Coptis chinensis on intestinal flora and mucinophilic probiotics A.muciniphila in intesting mucosal barrier of ulcerative colitis（UC） mice.Methods UC mice models were induced by dextran sodium sulfate（DSS） and divided into blank control group， model group， mesalazine group（65 mg/kg， tid） and Coptis chinensis group（0.3 g/kg， qd）. After successful modeling， corresponding drugs or distilled water were given for 10 days. On the 18th day of the experiment， fresh feces of mice were collected and DNA was extracted with fecal genomic DNA kit. ERIC-PCR and A.mucinipila gene specific primers were designed. ERIC-PCR was used to detect the bacterial diversity in feces. Semi quantitative PCR was used to reflect the changes of A.mucinipila bacteria in each group Organizational change.Results ERIC-PCR results showed that compared with the normal group， the number of bands in the model group was not significantly reduced， but the location of the bands was significantly changed. The number of bands in the Coptis chinensis group was significantly reduced， but compared with the mesalazine group， the diversity of intestinal flora was improved; the semi quantitative PCR results showed that compared with the normal group， the strip number of model group was slightly obvious， the mesalazine group was slightly dark， and the brightness of Coptis chinensis group was significantly increased which means the abundance of A.mucinipila increased. Pathological section esults showed that compared with the normal group， the normal structure of intestinal crypt and gland in the model group was destroyed， and a large number of inflammatory cells infiltrated into the mucosal layer. Compared with the model group， the degree of mucous membrane damage in mesalazine group and Coptis chinensis group was less， the damage of gland structure was lighter， the number and infiltration depth of inflammatory cells were significantly reduced Less.Conclusion Coptis chinensis can regulate the composition of intestinal flora in DSS induced UC model mice， increase the abundance of A.muciniphila flora， and improve the inflammation of UC model mice.3ABA55F6-DD74-4AC4-ABD5-C61A92410E3B

Key words：Coptis Chinensis; Ulcerative Colitis; ERIC-PCR; Semi Quantitative PCR; Mucinophilic Probiotics

溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis，UC） 在中医属于中医的“肠僻”“痢疾”“泄泻”等范畴，是一种原因不明的慢性非特异性结肠炎性疾病，病变多从直肠开始，主要限于结肠的粘膜，呈持续性、弥漫性分布，病理表现主要为固有膜内弥漫性急、慢性炎症细胞浸润，尤其是肠上皮细胞（Intestinal epithelial cells， IEC）间中性粒细胞浸润及隐窝炎乃至隐窝脓肿。肠黏膜屏障损伤及由此造成的肠壁通透性增高是UC发病的始动因素和病情进展的核心环节^[1]。IEC是肠道黏膜屏障与抗原接触的第一线，其屏障作用可抵挡致病菌、共生菌和食物抗原入侵，IEC损伤可致使肠道内大量抗原与肠道免疫细胞接触并使之激活，产生大量炎性因子，造成肠道组织损伤^[2]。

肠道微生物的群落组成和多样性改变会影响肠道内环境的稳态，菌群失调会促进结肠炎的发展^[3]。肠道益生菌与肠道黏膜屏障的组成密切相关，肠道菌群代谢产物短链脂肪酸（SCFA）以GPR43依赖的方式促进肠上皮肠样体产生RegIIIγ和β-防御素，通过该途径调节IEC表达抗菌肽（AMP）和肠道内稳态^[4]。肠道菌群失调与免疫功能异常直接影响着UC的演变^[5]，嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila，A.muciniphila）的代谢产物丙酸对机体有明确的免疫调节作用，在糖尿病、肥胖症、溃疡性结肠炎、结肠癌等多种疾病中具有重要的作用^[6]。

黄连清热燥湿，泻火解毒是诸多治疗溃疡性结肠炎的方剂中的主要成分，黄连中的盐酸小檗碱和黄连碱^[7]等多种成分在治疗溃疡性结肠炎中也具有重要作用。笔者参与的前期研究发现黄连解毒汤对大鼠肠道内的A.muciniphila菌有促进作用^[8]。为进一步研究黄连对其在UC小鼠中的影响，本研究通过与传统药物美沙拉嗪进行对比实验，用肠杆菌基因间重复一致序列聚合酶链反应（ERIC-PCR）和半定量PCR对各组粪便样本中的菌群结构和特定益生菌A.muciniphila进行检测，综合肠道组织病理切片的黏膜组织受损及恢复情况进行分析，探究黄连对UC疾病中菌群失调下特定益生菌A.muciniphila对肠道组织粘膜屏障的影响。

1 材料

1.1 实验动物 6周龄KM小鼠40只，雌雄各半，体重（20±2）g，购自长沙市天勤生物技术有限公司，动物使用许可证号：SCXK（湘）2019-0014。

1.2 试剂与药品 右旋葡聚糖硫酸钠（DSS，批号：H02J9B62777，Sigma-Aldrich公司）;中草药黄连（北京同仁堂）;美沙拉嗪（批号：17G27518L，莎尔福公司）;粪便基因组DNA提取试剂盒（批号：S8114，TIANGEN公司）;快捷型琼脂糖DNA回收试剂盒Ⅱ型（北京百泰克生物公司）;2×Taq PCR MasterMix、溶菌酶（北京天根生化科技有限公司）。

2 方法

2.1 药物制备及给药方法 根据参考徐叔云教授主编的《药理实验方法学》按体表面积计算剂量来算，人和小鼠间体表面积折算的等效剂量比值为0.0026，换算所得：若70 kg体重人的临床剂量为X mg/kg，20 g体重小鼠的剂量=X mg/kg×70 kg×0.0026/0.02 kg=9.1×X mg/kg，因美沙拉嗪成人UC治疗每次口服用量已知0.5g，即（X mg/kg×70 kg）=500 mg，则不需要在计算时×70 kg，即500 mg×0.0026/0.02 kg=65 mg/kg，则小鼠1次给药剂量按0.65 mg/10 g比值进行换算，配制成6.5 mg/mL的药液，按0.1 mL/10 g小鼠灌胃给药体积，1天3次（tid）灌胃给药;从北京同仁堂购入黄连，制备水煎药。换成中药黄连以克（g）为单位即是9.1×X g/kg。参考李国辉等^[9-10]实验研究，为避免对小鼠产生抑菌效果和脑神经损伤，最终将给药剂量定为0.3 g/kg。取3 g黄连，用100 mL去离子水泡20 min，水煎30 min左右，再补足去离子水至100 mL即为3×10^-2g/mL浓度。给药剂量0.3 g/kg即是3×10^-3g/10 g，则一只体重20 g的小鼠给药量为6×10^-3g，即按3×10^-2g/mL劑量取0.2 mL，一天一次（qd）灌胃给药。

2.2 分组及UC模型制备 小鼠按随机数字表法分为空白对照组、模型组、美沙拉嗪组（65 mg·kg^-1）、黄连组（0.3g·kg^-1），每组10只。空白对照组给予蒸馏水，参考李望等^[11]、吴昊等^[12]和胡仁伟等^[13]探讨总结的诱发小鼠较理想的UC模型的方法，用葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导制备UC小鼠模型，各组采用灌胃3% DSS溶液连续7 d，诱导UC模型，第8天开始全部换成蒸馏水。造模成功后第1天开始灌胃给药，除空白对照组与模型组给予蒸馏水外，其余各组按上述剂量给予相应的药物，连续给药10 d。

2.3 小鼠病活动指数评分（Disease activity index，DAI） 观察及疾病活动度评估自造模之日起，每日观察并记录小鼠精神状态、进食、饮水和活动度等一般情况，每日定时称量小鼠体重，观察粪便情况及便血状态，参照文献^[14]进行疾病活动评分。评分依据为黏着在肛门的水样便为稀便，不黏着于肛门的糊状大便为半稀便，成型的粪便为正常便。计算方法为DAI=（体质量+大便性状分数+隐血分数）/3。3ABA55F6-DD74-4AC4-ABD5-C61A92410E3B

2.4 引物设计与合成 根据前期的研究^[8]，设计引物序列： ERIC-1：5-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3，ERIC-2： 5-AAGTAAGTGACT GGGGTGAGCG-3;根据秦倩倩^[15]等的研究，合成A.muciniphila细菌基因特异性引物，上游引物：5-CAGCACGTGAAGGTGGGGAC-3，下游引物：5-CCTTGCGGTTGGCTTCAGAT-3，基因全长：329 bp;由上海生工生物工程有限公司合成。

2.5 各组样品基因组模板制备 DNA实验第18天，收集小鼠新鲜粪便，用粪便基因组DNA试剂盒说明书严格进行操作，提取基因组DNA，用核酸浓度检测仪测定提取的DNA模板的纯度及浓度，确保DNA纯度A260/A280 比值在1.8左右，浓度在200 ng/μL左右，均置于-20 ℃保存备用。

2.6 ERIC-PCR反应体系 反应体系为： DNA 模板2 μL，10 μmol /L 上、下游引物各0.5 μL，2×Taq PCR MasterMix [0.1U Taq Polymerase/μL， 500 μmol dNTP each， 20 mmol Tris-HCl（pH值为8.3）， 100 mmol KCl，3 mmol MgCl2]12.5 μL，ddH2O 补足至25 μL。反应条件为： 95 ℃ 预变性 7 min;95 ℃ 变性 30 s，46 ℃ 退火 90 s，72 ℃ 延伸 3 min，共35个循环;72 ℃ 延伸 5 min。

2.7 A.muciniphila菌半定量PCR反應体系 反应采用20 μL体系：模板2 μL，10 μmoL/L 上下游引物各0.3 μL，2×Taq PCR MasterMix 10 μL，去离子水补充体系至20 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性10 min;95 ℃变性30 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸30 s，39个循环，65 ℃ 延伸 10 min。

2.8 条带克隆测序与序列分析 选取A.muciniphila菌半定量PCR产物目的条带，按琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书回收DNA。收集菌体送上海生工生物有限公司测序，将测序结果与 GenBank 中已登录的细菌 DNA 序列用 BLAST软件进行比对分析。

2.9 肠道组织病理学检测 组织置于10%福尔马林溶液中放置24 h以上，将组织修正大小为1.0 cm×1.0 cm×0.2 cm，放入包埋盒冲洗12 h，沥干水后，分别置于无水乙醇100%、95%、90%，85%、80%、70%酒精1 h;二甲苯1、二甲苯2各30 min，置于左右蜡缸各一个小时，冰冻切片后，置于切片机，将肠道组织切到5 μm厚，后进行展片、铺片，将装有组织的载玻片放入烘干箱12 h，按照切片盒步骤依次对组织进行HE染色，观察切片结果。

3 结果

3.1 各组小鼠体质量的变化 记录各组小鼠造模开始后至治疗期间每天的体质量变化。对照组体质量呈现上升趋势;造模开始后各造模组小鼠从造模第3天起，体质量下降较对照组有统计学意义（P<0.05）;治疗开始后，各组小鼠体质量有所回升，模型组小鼠停用DSS后开始自愈，但体质量较黄连组和美拉沙秦组恢复缓慢。如图1所示。

3.2 DAI 评分结果 造模成功后模型组、美沙拉嗪组和黄连组小鼠均出现精神呆滞、行动缓慢、便血、体重下降，而空白对照组小鼠精神、活动度、饮食、毛发、大便、体重等一般情况均为正常。随着药物治疗的进行，美沙拉嗪组和黄连组的DAI较治疗前均减轻（P<0.01），较模型组DAI有显著下降（P<0.01），美沙拉嗪组和黄连组之间相比差异无统计学无意义（P>0.01）。见表1。

3.3 肠道菌群结构 ERIC-PCR结果 肠道菌群的多样性，与正常组相比，模型组条带数量没有明显减少，说明肠道菌群的多样性没有明显变化， 但是条带位置变化较明显，说明菌群紊乱，但肠道菌群的丰度减少。美沙拉嗪组条带数量明显减少，提示菌群基因组DNA含量明显减少，肠道菌群的多样性抑制，黄连组条带数量也明显减少，但比美沙拉嗪组多。如图2所示。

3.4 A.muciniphila菌半定量PCR结果 半定量PCR亮度与正常组相比，模型组条带稍明显，提示A.muciniphila菌群丰度有所升高，美沙拉嗪组稍暗，提示菌群丰度有所降低黄连组亮度明显升高，提示菌群丰度明显升高。如图3所示。

3.5 条带克隆测序与序列分析 克隆测序结果显示与GenBank 中已登录的细菌 DNA 序列（NR_042817.1）用 BLAST软件进行比对分析结果一致，属于Akkermansia muciniphila ATCC BAA-835 strain Muc 16S ribosomal RNA， partial sequence，基因全长329 bp。如图4所示。

3.6 HE染色及病理组织切片 正常组，镜下可见结肠粘膜完整，光滑，腺体层次清楚、清晰可见，未见糜烂、溃疡及中性粒细胞浸润等（图5-a）;模型组，结肠粘膜广泛溃疡发生，组织充血、水肿明显，粘膜上皮排列紊乱、破裂损伤，细胞核集聚、模糊且伴有细胞脱垂，肠绒毛缺损，组织内见大量炎性细胞浸润，以中性粒细胞为主（图5-b）;美沙拉嗪组（图5-c）、黄连组（图5-d），上皮细胞较整齐，黏膜溃疡情况减轻，组织充血、水肿减轻，炎性充血细胞减少，细胞破裂减少。

4 讨论

肠道菌群参与固有免疫和适应性免疫，黏膜上皮组织屏障作用是黏膜局部固有免疫的重要机制，肠道黏膜表面存在的共生菌群通过竞争而阻止病原微生物黏附肠道黏膜及感染机体，可产生某些抗微生物物质。如大肠杆菌产生大肠杆菌素等，有助于维持IEC稳态，并参与修复肠炎所致的黏膜损伤^[2]。肠道菌群代谢产物短链脂肪酸是IEC的直接能量来源，例如，丙酸可通过G蛋白偶联受体43肠道黏膜免疫系统起到调节作用;丁酸可以促进Treg细胞的外周活化，增加结肠中Treg细胞亚群数量，抑制促炎免疫细胞CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞活性^[16]。因此，肠道微生态系统菌群失调是UC发生发展的重要原因之一，肠道细菌刺激树突状细胞（DC）分泌IL-23，激活Th-17细胞并分泌IL-17和其他细胞因子，介导炎症反应^[2，17]。3ABA55F6-DD74-4AC4-ABD5-C61A92410E3B

A.muciniphila菌在肠道的外黏液层中定植，肠道黏蛋白是其生存增殖的唯一碳源和氮源，A.muciniphila分解黏蛋白并刺激杯状细胞合成黏蛋白达到动态平衡，从而维持黏液层的稳定^[15]。黏蛋白增多可促进肥胖、糖尿病、心脏代谢疾病和轻度炎症^[13]，A.muciniphila菌降解黏蛋白的特性使其成为维持肠道黏膜屏障的关键微生物^[14]。在治疗难治性慢性活动性溃疡性结肠炎时，含有高丰富度的A.muciniphila粪便样本似乎有利于进行粪便菌群移植^[18]。

黄连清热燥湿，泻火解毒是诸多治疗溃疡性结肠炎的方剂中的主要成分，其中盐酸小檗碱、黄连碱等多种成分在治疗溃疡性结肠炎中也具有重要作用^[7]。体外试验证明，黄连或小檗碱对溶血性链球菌、脑膜炎球菌、肺炎双球菌、霍乱弧菌、炭疽杆菌以及金黄色葡萄球菌皆有较强的抑菌作用，但其对溃疡性结肠炎中的菌群紊乱的调节作用机制尚不明确。

研究用ERIC-PCR和半定量PCR技术分析黄连对溃疡性结肠炎小鼠模型结肠段A.muciniphila细菌的定殖数量变化，综合肠道组织病理切片观察分析黄连对溃疡性结肠炎肠粘膜屏障和机体炎症反应的影响。研究表明，A.muciniphila细菌在模型组小鼠肠道中有一定增殖情况，这与黏蛋白在结肠炎肠道中增加有关。美沙拉嗪對A.muciniphila细菌较弱的抑制作用，可能是因为治疗炎症的效果和本身的抑菌作用导致黏蛋白减少而导致其减少。黄连对DSS诱导的UC模型小鼠肠道中的A.muciniphila细菌有明显促进增殖的作用，因黄连本身具有的抑菌作用和抗炎效果，但可能抑制的菌群种类和数量不同，其具体促进A.muciniphila菌增殖机制还需进一步研究。

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（收稿日期：2021-07-12 编辑：刘 斌）3ABA55F6-DD74-4AC4-ABD5-C61A92410E3B