上皮性卵巢癌患者血清miR-302b-3p、lncRNA SNHG16水平变化及其临床意义

刘景云，杨斌 ，熊丽，周静，王倩，张月

1 唐山市中医医院妇科内分泌科，河北唐山 063000；2 东部战区总医院秦淮医疗区妇产科；3 唐山市中医医院肿瘤科

卵巢癌是病死率最高的妇科恶性肿瘤，据报道，全世界每年死亡病例超过15 万例［1］。上皮性卵巢癌是卵巢癌最常见的病理类型，占所有卵巢癌的85%～90%［2］。近年来，上皮性卵巢癌的治疗策略不断改进，已从传统的放化疗转向现在的新辅助放化疗、靶向治疗、免疫治疗等综合治疗，但治疗后复发仍不可避免，5 年生存率依然不高［3］。因此，早期诊断和治疗仍然是提高上皮性卵巢癌患者生存期的关键。非编码RNA 是一类不参与编码蛋白质的RNA，如微小RNA（miRNA）、长链非编码RNA（lncRNA），但能够在转录或转录后水平调控基因的表达。miRNA是人体内广泛分布的内源性非编码RNA，能够参与调控细胞的增殖、分化、凋亡等生物学行为，与恶性肿瘤的发生、发展密切相关。miR-302b-3p是miRNA家族成员之一，能够参与胃癌、非小细胞肺癌、宫颈癌等恶性肿瘤的发生、发展［4］。lncRNA 是具有高度组织特异性的非编码RNA，在表观遗传、转录后基因表达、基因结构重塑、组蛋白修饰等过程中发挥重要作用［5］。SNHG16 是 lncRNA 家族成员之一，可通过miRNA 分子海绵作用调控细胞的增殖和分化，从而参与肿瘤进展及化疗耐药［6］。但miR-302b-3p、lncRNA SNHG16 与上皮性卵巢癌的关系鲜有报道。本研究探讨了上皮性卵巢癌患者血清miR-302b-3p、lncRNA SNHG16 水平变化及其临床意义。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择 2018 年 2 月—2021 年 1 月唐山市中医医院收治的上皮性卵巢癌患者83例（恶性组），均经组织病理检查确诊。纳入标准：①符合上皮性卵巢癌诊断标准；②年龄＞18 岁；③初诊，入院前未接受任何抗肿瘤治疗；④临床病理资料完整。排除标准：①合并其他部位恶性肿瘤者；②合并自身免疫性疾病或感染性疾病者；③合并重要脏器严重疾病者；④合并急慢性感染者；⑤近1个月内服用免疫抑制剂、激素类药物治疗者。患者年龄42～65（58.12± 5.49）岁，孕次0～5（3.25± 0.79）次，产次0～4（2.12 ± 0.39）次；病理类型：浆液性癌68例，其他15 例；组织分化程度：中高分化31 例，低分化52例；FIGO 分期：Ⅰ、Ⅱ期21例，Ⅲ、Ⅳ期62例；有淋巴结转移35例，有远处转移15例。同期选择唐山市中医医院收治的良性卵巢肿瘤患者34例（良性组），均经组织病理检查证实。患者年龄41～69（58.72 ±5.66）岁，孕次 0～5（3.15 ± 0.71）次，产次 0～3（2.01 ± 0.36）次；病理类型：卵巢黏液性囊腺瘤9例，卵巢子宫内膜样肿瘤8 例，输卵管腺瘤样瘤10例，输卵管乳头状瘤7例。同期另选在唐山市中医医院体检健康的女性志愿者29例（对照组），年龄40～67（58.79 ± 5.63）岁，孕次0～5（3.02 ± 0.85）次，产次0～3（2.05 ± 0.32）次。三组年龄、孕次、产次具有可比性。本研究经唐山市中医医院医学伦理委员会批准（审批编号：20180451）。所有研究对象或其家属知情同意并签署书面知情同意书。

1.2 血清miR-302b-3p、lncRNA SNHG16 检测 恶性组、良性组入院次日，对照组体检当日，采集空腹肘静脉血3 mL，置于干燥试管中，室温静置30 min，688×g离心5 min，留取上层血清。按mirVana™miRNA Isolation Kit说明提取血清总RNA，经Agilent 2100生物分析仪鉴定，OD260/OD280为1.8～2.0。按M-MLV逆转录酶说明将总RNA 逆转录为cDNA。以cDNA为模板，按照SYBR Premix Ex Taq™Ⅱ试剂盒说明进行PCR 扩增。所有引物由上海生工生物工程股份有限公司设计合成。miR-302b-3p 上游引物5'-ATCCAGTGCGTGTCGTG-3'、下游引物 5′-TGCTTAAGTGCTTCCATGTT-3'，U6 上游引物 5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'、下 游 引 物 5'-AACGCTTTCACGAATTTGCGT-3'。 lncRNA SNHG16 上 游 引 物 5'-GCAGAATGCCATGGTTTCCC-3'、下游引物 5'-GGACAGCTGGCAAGAGACTT-3'，GAPDH 上游引物 5'-GATATTGTTGCCATCAATGAC-3'、下游引物 5'-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3'。 PCR 反 应 体 系 共20 µL：cDNA 模板 2 µL，上下游引物各 1 µL，Taq DNA 聚合酶 1 µL，dNTP 1.6 µL，10 × Buffer 2 µL，RNase-Free ddH2O 补足至 20 µL；反应条件：95 ℃15 min，94 ℃ 15 s、55 ℃ 30 s、70 ℃ 30 s 共 40 个循环。PCR 反应在 Applied Biosystems®StepOne™实时荧光定量PCR 仪上完成。反应结束，绘制熔解曲线，收集循环阈值（CT）数。以 U6 或 GAPDH 为内参，采用2-ΔΔCT法计算 miR-302b-3p、lncRNA SNHG16相对表达量。

1.3 统计学方法 采用SPSS25.00 统计软件。计量资料经Shapiro-Wilk 检验符合正态分布，以表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验；两组比较采用独立样本t检验。计数资料比较采用χ2检验。相关性分析采用Pearson 相关分析法。预测效能分析采用受试者工作特征（ROC）曲线。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组血清 miR-302b-3p、lncRNA SNHG16 水平比较 见表1。

表1 三组血清miR-302b-3p、lncRNA SNHG16水平比较（）

表1 三组血清miR-302b-3p、lncRNA SNHG16水平比较（）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与良性组比较，#P＜0.05。

组别对照组良性组恶性组n 29 34 83 F P lncRNA SNHG16 0.65±0.17 0.69±0.18 1.65±0.33*#226.976＜0.05 miR-302b-3p 2.01±0.35 1.98±0.31 1.02±0.27*#193.130＜0.05

2.2 上皮性卵巢癌患者血清miR-302b-3p、lncRNA SNHG16水平与临床病理特征的关系 见表2。

表2 上皮性卵巢癌患者血清miR-302b-3p、lncRNA SNHG16水平与临床病理特征的关系

2.3 上皮性卵巢癌患者血清miR-302b-3p 水平与血清lncRNA SNHG16 水平的关系 Pearson 相关分析显示，上皮性卵巢癌患者血清miR-302b-3p水平与血清lncRNA SNHG16水平呈负相关关系（r=-0.678，P＜0.05）。见图1。

图1 上皮性卵巢癌患者血清miR-302b-3p水平与血清lncRNA SNHG16水平关系的散点图

2.4 血清 miR-302b-3p、lncRNA SNHG16 水平对上皮性卵巢癌的诊断效能分析 血清miR-302b-3p 水平诊断上皮性卵巢癌的曲线下面积（AUC）为0.664（95%CI：0.571～0.749），最佳截断值为1.50，此时其诊断上皮性卵巢癌的灵敏度为72.29%、特异度为67.65%；血清lncRNA SNHG16 水平诊断上皮性卵巢癌的AUC为0.742（95%CI：0.653～0.818），最佳截断值为1.17，此时其诊断上皮性卵巢癌的灵敏度为75.90%、特异度为73.53%；血清CA125水平诊断上皮性卵巢癌的AUC为 0.579（95%CI：0.485～0.670），最佳截断值为200 U/mL，此时其诊断上皮性卵巢癌的灵敏度为61.45%、特异度为58.82%；血清miR-302b-3p、lncRNA SNHG16 水平联合诊断上皮 性 卵 巢 癌 的AUC为 0.898（95%CI：0.829～0.947），其诊断上皮性卵巢癌的灵敏度为90.36%、特异度为88.24%。血清lncRNA SNHG16 水平诊断上皮性卵巢癌的AUC高于血清CA125 水平（Z=3.121，P＜0.05），血 清 miR-302b-3p 水 平 与血 清CA125水平诊断上皮性卵巢癌的AUC比较差异无统计学意义（Z=1.670，P＞0.05）；血清 miR-302b-3p、lncRNA SNHG16 水平联合诊断上皮性卵巢癌的AUC明显高于血清 miR-302b-3p、lncRNA SNHG16单独（Z分别为4.245、3.447，P均＜0.05）。见图2。

图2 血清miR-302b-3p、lncRNA SNHG16水平单独或联合诊断上皮性卵巢癌的ROC曲线

3 讨论

卵巢癌是妇科恶性肿瘤中病死率最高的肿瘤，其最常见的病理类型为上皮性卵巢癌。近年来，细胞减灭术及后续以铂类/紫杉烷为基础的化疗虽然能够在一定程度上延长上皮性卵巢癌患者生存期，但复发和获得性化疗耐药始终无法避免［7］。目前，临床主要依靠血清肿瘤标志物CA125 以及盆腔超声、CT 或MRI 等检查辅助诊断上皮性卵巢癌，但灵敏度和特异度较低，且不能满足早期诊断要求。因此，探索更灵敏、特异的生物标志物对上皮性卵巢癌的早期诊断至关重要［8］。

miRNA 是人体内广泛分布的内源性非编码RNA，能够在转录后调节几乎所有发育途径和生物学过程，在干细胞分化、细胞状态转变期间发挥重要作用。miR-302b-3p是胚胎干细胞周期调节miRNA，属于miR-302 基因簇，可调节染色质状态，调控细胞分化、凋亡及细胞周期，能够提高胚胎干细胞活力，促使胚胎干细胞存活和自我更新［9］。近年有研究报道，miR-302b-3p 在胃癌组织中表达下调，并能通过抑制含有Rho 相关卷曲螺旋蛋白激酶2 表达，抑制肿瘤细胞增殖、侵袭、迁移，并促进其凋亡［10］。miR-302b-3p 在结直肠癌中表达下调，转染miR-302b-3p后可抑制肿瘤细胞侵袭并促进其凋亡［11］。在喉鳞状细胞癌中，miR-302b-3p 可抑制胰岛素样生长因子1受体表达，进而抑制肿瘤进展［12］。本研究结果发现，miR-302b-3p在上皮性卵巢癌中亦表达下调，且其表达与肿瘤FIGO 分期、组织分化程度、淋巴结转移和远处转移有关。结果表明，miR-302b-3p表达缺失与上皮性卵巢癌进展有关，miR-302b-3p在上皮性卵巢癌中可能发挥抑癌基因作用。

lncRNA 是一类长度超过200 个核苷酸的非编码RNA。lncRNA表达失调会诱导基因异常表达，从而促进人类恶性肿瘤的发生、发展。SNHG16 是一种与肿瘤相关的lncRNA，能够通过靶向调控miRNA发挥抑癌或致癌作用［13］。有研究报道，lncRNA SNHG16 在肝细胞癌中表达下调，并能够通过靶向Hsa-miR-93 抑制肝癌细胞增殖［14］。在肺癌细胞中lncRNA SNHG16 表达上调，并通过与 miR-520 结合上调血管内皮生长因子表达，促进肺癌细胞迁移［15］。lncRNA SNHG16 在胃癌中表达上调，且通过下调Wnt 信号通路抑制剂Dickkopf-3 促进上皮间质转化，增强胃癌细胞侵袭能力，促进胃癌进展［13］。本研究结果发现，lncRNA SNHG16 在上皮性卵巢癌中表达上调，且其表达与肿瘤FIGO 分期、组织分化程度、淋巴结转移和远处转移有关。结果表明，lncRNA SNHG16 在上皮性卵巢癌中可能发挥致癌基因作用，与 YANG 等［16］研究结果一致，SNHG16 可能通过激活蛋白激酶B 磷酸化，上调基质金属蛋白酶9表达，促进卵巢癌细胞增殖、侵袭和迁移。

lncRNA 作为miRNA 的前体，可通过诱导染色质修饰、调控信使RNA 或作为竞争性内源RNA（ceRNA）与靶基因竞争性结合miRNA，参与核糖核酸甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑等，从而诱发肿瘤的发生、发展［17］。本研究结果发现，上皮性卵巢癌患者血清lncRNA SNHG16 水平与血清miR-302b-3p水平呈负相关关系，表明lncRNA SNHG16 可能通过负向调控miR-302b-3p 表达促使上皮性卵巢癌的发生 。 XU 等［18］研 究 报 道 ，lncRNA SNHG16 存 在miR-302b-3p 的靶向结合位点，可充当miR-302b-3p的分子海绵，从而调控miR-302b-3p 表达。王茜等［19］研究结果显示，lncRNA SNHG16 能够靶向结合miR-302b-3p，从而调控卵巢癌细胞增殖、侵袭和迁移。

本研究ROC 曲线分析显示，血清miR-302b-3p、lncRNA SNHG16 水平诊断上皮性卵巢癌的AUC分别为0.664、0.742，灵敏度分别为72.29%、75.90%，特异度分别为67.65%、73.53%，提示血清miR-302b-3p、lncRNA SNHG16水平对上皮性卵巢癌均具有一定诊断价值。当血清miR-302b-3p、lncRNA SNHG16水平联合时，其诊断上皮性卵巢癌的AUC达到0.898，灵敏度和特异度分别为90.36%、88.24%。结果表明，血清 miR-302b-3p、lncRNA SNHG16 水平联合时能够明显提高对上皮性卵巢癌的诊断价值。

综上所述，上皮性卵巢癌患者血清miR-302b-3p水平下调、血清lncRNA SNHG16水平上调，二者呈负相关关系并与肿瘤FIGO分期、组织分化程度、淋巴结转移、远处转移密切相关；血清miR-302b-3p、lncRNA SNHG16水平对上皮性卵巢癌均具有一定诊断价值，二者联合时诊断价值更高。但本研究存在一定局限性，尚不能证实lncRNA SNHG16对miR-302b-3p的直接调控作用，今后仍需进一步研究证实。