银环蛇咬伤致肌无力SD大鼠模型建立*

陈少英, 晏平△, 梁庆, 梁子敬, 刘荣, 李燕, 许启锋

广州医科大学附属第一医院 1急诊科，3神经内科(广东广州 510120)；2广东省中医院急诊科(广东广州 510120)

在我国,银环蛇咬伤占各类毒蛇咬伤的8.2%，居第5位，而其致死亡的人数却居蛇伤的首位[1]。银环蛇咬伤后，多数患者在1～4 h后出现全身中毒症状，常表现为全身骨骼肌无力，此症状出现的一般顺序为先见四肢无力，继而出现眼睑下垂、吞咽困难、流涎、四肢瘫痪、呼吸困难，严重者可因呼吸肌麻痹，出现呼吸衰竭死亡，呼吸肌麻痹占一半以上[2]。临床上银环蛇咬伤的救治按照毒蛇咬伤程序化综合救治法方法抢救，主要包括：尽早局部清创破坏毒素，尽早足量使用抗银环蛇毒血清，纠正毒效危象(气管插管、机械通气、血液净化等)，防治并发症，预防感染等[1，3]。蛇咬伤多发生于农村及山区，有效的抗银环蛇毒及机械通气治疗，难以及时提供。研究既可以尽早、便捷、安全、广泛使用的药物，可以为银环蛇咬伤患者争取救治时间，是医生和患者迫切想得到的。在被银环蛇咬伤的患者身上进行药物临床试验，风险较大。2013年12月至2017年4月，本实验组通过应用KM小鼠检测所用银环蛇毒的毒力；采用不同剂量银环蛇干毒给予SD大鼠皮下注射，观察SD大鼠运动、呼吸等情况，确定模拟银环蛇咬伤早期肌无力所需模型的银环蛇干毒最佳剂量。为验证模型SD大鼠肌电图的变化，将模型SD大鼠与对照组SD大鼠行重复神经电刺激检查，并于建模后3 h取SD大鼠膈肌、腓肠肌行HE染色，了解肌肉细胞情况。通过本实验，模拟临床表现建立稳定、可重复性的，而又廉价的银环蛇干毒相关性早期肌无力的动物模型，为进一步研究提供基础，以促进银环蛇毒致肌无力机制和救治研究的发展。

1 材料与方法

1.1 实验动物 KM小鼠(18～22 g/20～30 d)，许可证号：SCXK(粤)2008-0002，50只，雌雄各半，购于广东省医学实验动物中心。SD大鼠(200～220 g/60～70 d)，许可证号：SCXK(粤)2008-0002，60只，雌雄各半，SPF级，购于广东省医学实验动物中心。

1.2 主要试剂和仪器 银环蛇干毒(南昌农大特种动物蛇类养殖场，批号：20130920)，美国Nicolet viking肌电图/诱发电位仪(美国Nicolet公司)。

1.3 方法

1.3.1 实验方案 本实验根据文献，银环蛇毒的KM小鼠半数致死量(LD50)为0.09 mg/kg，为检测本实验所用的银环蛇干毒的KM小鼠LD50，建立稳定的动物模型，按照其倍数将小鼠分为不同剂量组[1]，测定本实验银环蛇干毒KM小鼠LD50，根据公式换算[4]为银环蛇毒的SD大鼠LD50；按银环蛇毒的SD大鼠的LD50倍数，予SD大鼠皮下注射，建立银环蛇毒致SD大鼠肌无力模型，确定模拟临床的最佳银环蛇干毒剂量；用低频重复神经电刺激检测银环蛇毒致SD大鼠肌无力模型的腓肠肌电改变；解剖模型大鼠，观察膈肌及腓肠肌病理改变。实验流程见图1。

图1 银环蛇毒的KM小鼠LD50的测定

1.3.2 测定银环蛇毒的LD50(1)分组：实验分为5组，将体重为(20±2)g的KM小鼠50只，雌雄不限，随机分为不同的剂量组，每组10只。第1组为按体重皮下注射0.03 mg/kg银环蛇干毒组。第2组为按体重皮下注射0.09 mg/kg银环蛇干毒组。第3组为按体重皮下注射0.12 mg/kg银环蛇干毒组。第4组为按体重皮下注射0.15 mg/kg银环蛇干毒组。第5组为皮下注射生理盐水组。(2)操作方法：实验小鼠从医学实验动物中心送来后，在实验室室温下饲养7 d。实验前小鼠禁食12 h，不禁水。称重，根据分组计算所需银环蛇干毒剂量，给予小鼠皮下注射已配置好浓度的银环蛇毒溶液(浓度1 μg/mL)。将小鼠按照不同分组放置于标记剂量的饲养笼中，恢复饮食。24 h后，记录各组小鼠死亡数量。

1.3.3 建立银环蛇毒致SD大鼠肌无力的中毒动物模型

1.3.3.1 确定银环蛇毒致SD大鼠肌无力模型的剂量 (1)分组：按银环蛇毒的SD大鼠的LD50倍数，分A、B、C、D、E、F共6组，每组10只，雌雄各半，称重，采用不同剂量给SD大鼠皮下注射已配置的银环蛇毒溶液(浓度10 μg/mL)，A组为给予2倍SD大鼠LD50的银环蛇毒溶液；B组为给予3倍SD大鼠LD50的银环蛇毒溶液；C组为给予4倍SD大鼠LD50的银环蛇毒溶液；D组为给予10倍SD大鼠LD50的银环蛇毒溶液；E组为皮下注射生理盐水的对照组；F组为最佳中毒剂量模型组。(2)操作方法：注毒后观察中毒SD大鼠肌力、呼吸等情况，且未出现大鼠死亡，记录出现症状时间，确定本实验所需模型的最佳剂量，按最佳剂量建设模型组F组，并行重复神经电刺激检查。

按Lennon等[5]的分级法将肌无力症状分为4级：0级，没有肯定肌无力表现；1级，嘶咬无力，四肢力量较差，在光滑地面上前肢打滑，活动减少；2级，明显无力，休息时脊背呈隆起姿势，头尾下垂、前肢弯曲，动作不协调；3级，严重无力表现，无嘶咬动作，肌肉震颤，呼吸困难，濒死或死亡。其他症状描述参照文献[6]。

1.3.3.2 低频重复神经电刺激(RNS)检测 将F组SD大鼠10只用10%的水合氯醛(0.03 mL/kg)麻醉后固定于自制的解剖板上，将刺激电极放置于大鼠腹股沟处，横跨坐骨神经。记录电极置于腓肠肌内侧头(跟腱附着处)，参考电极插入腓肠肌肉内，地线插入刺激电极与记录电极之间，采用RNS软件进行操作。设置参数如下：增益1 mV/D，扫描速度2 ms/D，刺激强度20 mV，刺激频率分别采取1、3、5 Hz。实验大鼠在每一刺激频率中给予6次电刺激，记录腓肠肌肌电位。用第4个电位对第1个电位的变化百分比D表示衰减值。记录麻醉后大鼠腓肠肌的肌电图波幅衰减值后，予皮下注射银环蛇毒致SD大鼠肌无力模型的所需剂量，记录中毒后10 min及1、2、3 h肌电图衰减值。

1.3.3.3 SD大鼠的膈肌与腓肠肌细胞形态 E组和F组大鼠实验3 h后，放血处死，解剖，取膈肌、腓肠肌行HE染色，了解肌肉细胞形态情况。

2 结果

2.1 银环蛇毒LD50的确定 本实验中40只实验KM小鼠按照不同的剂量浓度皮下注射银环蛇毒溶液，24 h后观察各剂量组，观察KM小鼠死亡情况，0.03 mg/kg组小鼠全部存活，0.09 mg/kg组有50%小鼠死亡，0.12 mg/kg组有50%小鼠死亡，0.15 mg/kg组有90%小鼠死亡，生理盐水对照组全部存活。见表1。银环蛇毒的KM小鼠LD50为0.12 mg/kg，其95%可信区间为0.082～0.132。根据公式，换算成银环蛇毒的SD大鼠LD50为0.08 mg/kg。

表1 银环蛇毒剂量与小鼠死亡率

2.2 银环蛇毒致SD大鼠肌无力模型的剂量 实验中观察到大鼠中毒后，先出现易激惹，活动增多，后出现活动减少，动作减慢，之后出现口腔分泌物增多，喉鸣，张口呼吸，活动进一步减少。在C组和D组中可见，大鼠临终前出现口鼻、四肢、尾部发绀。A组3 h左右出现张口呼吸；B组2 h左右出现张口呼吸；C组和D组1 h左右出现张口呼吸，并于3 h内死亡；E组观察至27 h，未出现肌力减退和张口呼吸，全部存活。见表2。B组SD大鼠于1.5 h左右出现呼吸困难，模拟临床1～4 h出现呼吸衰竭，用于早期救治银环蛇干毒相关性早期肌无力的基础研究，所需模型的银环蛇毒最佳剂量是3倍SD大鼠LD50，为0.24 mg/kg。

表2 银环蛇毒剂量与中毒后肌无力、呼吸困难、死亡时间

2.3 RNS检查结果 F组SD大鼠为给予0.24 mg/kg银环蛇毒注射的SD大鼠，行RNS检查，中毒后，可见肌电递减改变；E组SD大鼠肌电检查无变化。F组SD大鼠所采集图形见图2。RNS检查的采集数值见表3。

表3 模型组与对照组SD大鼠RNS检查的采集衰减值[M(P25，P75)]%

注：A：RNS麻醉后；B：毒后10 min；C：毒后1 h；D：毒后2 h；E：毒后3 h

2.4 病理结果 高倍镜(×200)下模型组膈肌及腓肠肌细胞肿胀、核排列紊乱。对照组的膈肌与腓肠肌细胞形态未见异常。见图3。

图3 两组大鼠腓肠肌与膈肌细胞图(HE，×200)

3 讨论

既往也有很多银环蛇致动物咬伤的模型构建，用猪或兔子的模型太贵。本实验组曾用小鼠的膈肌肌条[7]、小鸡的颈肌鸡条[8]构建银环蛇毒中毒模型，但属于离体的实验，无法模拟经体循环后的中毒改变。银环蛇为剧毒蛇，一次排出毒量为4.6 mg，仅1 mg干毒就可置人于死地。关于蛇毒毒性强度的数据受多种因素的影响，如蛇的产地、采毒季节、饲养条件；蛇毒的处理情况、保持时间长短、保存方法等，均可影响其毒性。另外给药的途径不同，也可影响蛇毒毒性强度，其LD50的值也不一样[9]。根据文献银环蛇毒致小鼠皮下注射的LD50是0.09 mg/kg[1]。本实验所用银环蛇干毒取自人工饲养的银环蛇，为验证不同饲养条件对其毒力的影响，同时为建立稳定的动物模型，首先需要测定本批次银环蛇干毒的小鼠LD50，根据银环蛇毒致小鼠LD50，设定不同药物浓度梯度，给药方式采用皮下注射，24 h后确定小鼠死亡情况。通过实验结果显示，本批次通过人工饲养的银环蛇，处理所得的干毒的毒性强度为0.12 mg/kg。

银环蛇毒包括三指毒素(包括α-神经毒素)、磷脂A2(包括β-银环蛇毒素)等，银环蛇咬伤后，表现为前和突触后神经毒性[10]，多数患者在1～4 h后出现全身中毒症状，主要表现为肌无力，严重者可因呼吸肌麻痹，出现呼吸衰竭死亡。银环蛇咬伤最佳的救治时机是咬伤后2 h[11]，为观察到未及时处理的SD大鼠中毒情况，建模成功后，本实验的观察时间设置为中毒后3 h。在预实验中，根据由银环蛇毒致KM小鼠半数致死量，换算为SD大鼠的LD50为0.08 mg/kg，按其不同剂量倍数，予SD大鼠行皮下注射。观察注毒后大鼠肌力及呼吸改变情况，能自行恢复及死亡的剂量，不符合本实验要求。实验结果显示2～3倍LD50，在观察时间内出现了呼吸衰竭，且能保持存活，但2倍LD50致毒的大鼠在3 h左右出现张口呼吸，6 h恢复正常呼吸，为避免实验中个体差异，影响实验结果，予排除。给予SD大鼠注射4倍以上LD50，大鼠于2 h内死亡，不符合本实验要求。用3倍LD50致毒大鼠，1.5 h出现呼吸困难，并逐渐加重，但存活时间可超过12 h。

重复神经电刺激技术是用于评估可疑神经肌肉传递障碍的最广泛的电诊断方法[12]，最常用来研究神经肌肉传导障碍性疾病。神经肌肉传递阻滞时，在低频刺激时出现异常的递减反应[13-14]。本实验予3倍银环蛇毒LD50复制动物模型，行RNS检测，可见肌电呈递减改变，符合突触前异常，所致神经肌肉传递阻滞的重复神经电刺激改变。RNS检测方法，可在实验中检测肌力变化，从而提供客观的肌力分级指标。

银环蛇毒致SD大鼠中毒后，SD大鼠出现呼吸困难，从而导致组织缺氧，细胞氧供不足。当细胞氧供不足时，细胞酸中毒，细胞内线粒体呼吸和氧化磷酸化功能障碍，细胞内ATP不足使ATP酶依赖的各离子泵功能丧失，以及细胞膜功能障碍等改变，导致细胞水肿[15]。本实验观察膈肌及腓肠肌细胞，镜下可见细胞肿胀、核排列紊乱，与银环蛇咬伤后，病理解剖形态相符[1]。

本批次通过人工饲养的银环蛇，处理所得的干毒的SD大鼠的LD50为0.12 mg/kg。银环蛇咬伤致SD大鼠肌无力模型所需的干毒剂量为0.24 mg/kg，3倍SD大鼠银环蛇毒LD50。银环蛇毒致大鼠肌无力模型是稳定，具有可重复性的。银环蛇毒中毒大鼠行重复神经电刺激检测，表现为肌电递减改变；RNS检测方法可作为银环蛇咬伤后肌力检测的客观方法。

利益相关声明：所有作者无任何利益冲突。

作者贡献说明：陈少英：酝酿和设计实验、实施研究、采集数据、分析及解释数据、统计数据、撰写论文；晏平：指导和设计实验、实施研究、对论文的知识性内容作批评性审阅；梁庆：指导实验、研究经费支持；梁子敬：指导和设计实验、研究经费支持、对论文的知识性内容作批评性审阅；刘荣：指导统计分析；李燕：酝酿和设计实验。许启锋：协助实施研究。