宁夏四地区奶牛球虫病流行病学调查及虫种鉴定

牛晓昊 ， 黎玉琼 ， 郭亚男 ， 王 鑫 ， 李继东

(1.宁夏大学农学院 ， 宁夏 银川 750021 ； 2.宁夏农林科学院动物科学研究所 ， 宁夏 银川 750002)

牛球虫病(Bovine coccidiosis)是艾美耳球虫寄生于牛肠道上皮细胞引起的原虫病，具有严格的宿主特异性[1-2]。球虫寄生于肠上皮细胞可导致肠道严重损伤，出现不同程度的腹泻，偶尔可见血便。牛感染艾美耳球虫1周后，其肠黏膜就会被破坏，进而造成细菌继发感染，此时体温升高，前胃迟缓，肠蠕动增强，体液过度消耗。当转化为慢性病后，牛可出现长期下痢、贫血、形体消瘦等现象，给养殖户造成巨大的经济损失。国内外均有牛球虫病的报道。Koutny等[3]调查发现，奥地利在2010年的艾美耳球虫感染率为83.67%，并发现了11种艾美耳球虫，其中牛艾美耳球虫为优势虫种。Tamrat等[4]对埃塞俄比亚西北部的奶牛球虫调查结果显示，球虫感染是犊牛腹泻的主要因素。患球虫病的成年奶牛虽无明显症状，但免疫力和饲料转化率低，继而引发其他疫病[4]。国内的报道显示，北京、新疆、甘肃等都是奶牛球虫病的高发地区[5-7]。因此，防治牛球虫病是减少牛产业经济损失不可或缺的环节。

近年来，宁夏回族自治区大力发展畜牧业，奶牛球虫病也越来越被重视，但对该地区奶牛球虫病流行状况的了解还不够全面。本试验通过对宁夏四地区不同月龄的奶牛球虫病进行调查，分析不同月龄奶牛艾美耳球虫的球虫种类、感染率和感染强度，以期为宁夏奶牛球虫病的防治提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 显微镜(型号为OLYMPUS CX31)，购自上海富莱光学科技有限公司；计数板(型号为A3875)，购自上海富雪生物科技有限公司；胶头滴管、网筛、离心机(型号为Centrifuge 5810 R)，均购自雷德生物技术有限公司；培养箱(型号为HF90)，购自上海力申科学仪器有限公司；电子天平(型号为JD500-2)，购自西杰天平(北京)仪器有限公司；载玻片、盖玻片、烧杯、培养皿、氯化钠、重铬酸钾，均购自上海广诺化学科技有限公司；PBS缓冲液，购自金克隆(北京)生物科技有限公司。

1.2 样品来源 按照每个月龄段奶牛总数的15%比例随机采集样本，共采集1 938份粪样，通过直肠取样或采集新鲜粪样，随后立即放入盛有冰袋的保温箱里，并详细记录样本采集牛的圈舍、牛号、月龄以及粪样性状。样本带回实验室于4 ℃冰箱保存待检。本调查涉及的14个牛场在6个月内均没有使用过抗球虫药。

1.3 卵囊计数 通过麦克马斯特法对球虫卵囊进行计数。取2 g粪样置于干净的100 mL烧杯内，加入8 mL饱和食盐溶液，用玻璃棒捣碎混匀。再加入50 mL饱和食盐溶液，混匀后立即用60目筛网过滤。然后立即吸取滤液充满2个计数室，在显微镜载物台上静置3～5 min，在10倍物镜下镜检计数。每个计数室内有100个方格，其体积为1 cm×1 cm×0.15 cm=0.15 mL。分别查完2个计数室100个方格内的卵囊数量n1和n2，按照如下公式计算每克粪便中球虫卵囊数(OPG)[8-9]。

OPG=[(n1+n2)/(2×0.15)]×60÷2

1.4 球虫卵囊形态观察 收集保存镜检球虫卵囊呈阳性的粪样每份20 g，将粪样加入离心管内，加入适量水搅拌均匀。然后用40目和60目铜筛分别过滤，加PBS缓冲液3 500 r/min离心15 min，倾去上清液，重复1次。再加饱和食盐水2 000 r/min离心10 min，此时粪渣沉于管底，卵囊漂浮于饱和食盐水表面。移液枪吸取上清液注入含2.5%重铬酸钾溶液的培养皿中，保存于29 ℃的恒温箱中每6 h镜 检观察1次，待所有卵囊孢子化达到95%以上，得到孢子化卵囊，在400倍显微镜下观察卵囊形态[10-12]。

1.5 统计分析 采用SAS 8.2统计分析软件中的卡方检验，对宁夏不同地区的奶牛球虫发病率进行差异性分析。

2 结果

2.1 宁夏四地区不同牛场球虫的阳性率及感染强度 在宁夏四地区采集的1 938份新鲜粪样中，共检出856份为艾美耳球虫阳性，平均感染率为44.17%。 各牛场均存在感染情况，其中奶牛球虫病的最高阳性率为64.29%，最低阳性率为11.11%，最高平均OPG为5 776.32，最低平均OPG为283.58。每个牛场均存在混合感染，检出艾美耳球虫种类最多为12种，最少为2种。不同牛场奶牛艾美耳球虫感染率无统计学意义(P>0.05)。在本次调查中，石嘴山市、银川市、吴忠市和青铜峡市的奶牛球虫阳性率分别为46.38%、46.36%、50.00%和27.71%，其中吴忠市的奶牛球虫感染率最高，但平均OPG最大的是银川市(5 776.32), 见表1。青铜峡市的阳性率与其他3个市的阳性率相比差异极显著(P<0.01)。被检测出的艾美耳球虫种类分别有牛艾美耳球虫、柱状艾美耳球虫、邱氏艾美耳球虫、阿拉巴艾美耳球虫、奥博艾美耳球虫、巴西艾美耳球虫、拔克朗艾美耳球虫、加拿大艾美耳球虫、椭圆艾美耳球虫、皮利他艾美耳球虫、亚球形艾美耳球虫和怀俄明艾美耳球虫，共12种艾美耳球虫(见封底彩版图1)，并检出12 640个卵囊。

表1 宁夏四地区的不同牛场球虫的阳性率及平均OPG

2.2 宁夏四地区的艾美耳球虫感染种类及感染强度 本调查结果显示，宁夏四地区牛艾美耳球虫的感染率最高，为39.99%，是优势虫种，其次为柱状艾美耳球虫，感染率为20.17%，石嘴山市奶牛球虫的优势虫种为牛艾美耳球虫，银川市奶牛球虫的优势虫种为牛艾美耳球虫，吴忠市奶牛球虫的优势虫种为柱状艾美耳球虫，青铜峡市奶牛球虫的优势虫种为亚球形艾美耳球虫和牛艾美耳球虫。

2.3 宁夏不同月龄奶牛的球虫感染情况分析 各个月龄奶牛的球虫感染率不同，随月龄呈现增长趋势，1月龄以内犊牛球虫感染率最低，为11.32%，其中主要是大于21日龄的犊牛感染，小于21日龄的犊牛球虫感染率为0；2～3月龄犊牛球虫的平均感染强度最大，平均OPG为6 277.44；10～12月龄奶牛球虫的阳性率最高，为62.07%，平均OPG为1 574.31，见表2。不同月龄奶牛球虫的感染率统计学差异极显著(P<0.01)。

表2 不同月龄奶牛球虫感染情况

2.4 宁夏不同月龄奶牛感染艾美耳球虫的种类变化情况分析 不同月龄奶牛感染艾美耳球虫种类分析结果见图2。1月龄以内犊牛主要感染牛艾美耳球虫，2～3月龄犊牛主要感染柱状艾美耳球虫，4～6月龄 奶牛主要感染牛艾美耳球虫和皮利他艾美耳球虫，7～9月龄奶牛主要感染亚球形艾美耳球虫和牛艾美耳球虫，10～12月龄奶牛主要感染牛艾美耳球虫和亚球形艾美耳球虫。不同月龄奶牛的优势虫种也不一样，牛艾美耳球虫和邱氏艾美耳球虫致病性最强，最容易危害犊牛。

图2 宁夏四地区不同月龄奶牛感染艾美耳球虫种类所占百分比

3 讨论

近年来，奶牛球虫病的发病率不断上升，养殖户对奶牛球虫病也非常重视。张宽宽等[13]在2016年 对新疆7个地区18个规模化奶牛场球虫病的流行调查显示，球虫总感染率为35.0%(487/1 391)， 7～12月龄奶牛球虫感染率最高，为48.8%。蒋业慧等[14]调查新疆奎屯地区5个规模化奶牛场发现，其奶牛球虫平均感染率为34.14%(99/290)，2～3月龄犊牛球虫感染强度最大，平均OPG为14 456。金兰梅等[15]在2008年对江苏部分地区奶牛场采集粪样的调查结果显示，奶牛球虫感染率为33.52%(704/2 100)，其中2～6月龄奶牛球虫感染率最高，为50.00%，0～1月龄犊牛感染率最低，为12.38%。倪晓婷等[16]在2015年对宁夏奶牛球虫病的调查发现，宁夏奶牛球虫平均感染率为27.46%(117/426)。本调查发现，宁夏四地区奶牛球虫的平均感染率为44.17%(856/1 938)，均高于我国已报道各地的奶牛球虫病的调查结果。与倪晓婷等[16]的研究出现差异的原因可能与采集地区、奶牛场和样本数量有关。这些调查报告结果进一步说明，奶牛球虫病流行较普遍，以往长期添加抗球虫药，很大程度上掩盖了球虫病流行严重的事实，随着国家限抗、禁抗政策的全面实施，尤其是离子载体抗生素在饲料中的禁用，使得奶牛球虫的发病率出现激增现象，因此更加需要注意综合防控。

本调查发现，球虫感染普遍存在于宁夏各个牛场，四地区的不同牛场球虫感染率也存在差异，这与牛场的管理理念有很大关系，如断奶犊牛的管理以及环境卫生的要求等。其中1月龄以内犊牛的优势虫种为牛艾美耳球虫，其致病性最强，对犊牛的危害也最严重。犊牛球虫病的发病原因很多，断奶应激和转群应激都可能导致犊牛发病，其次就是犊牛饲养密度要合适，密度过大更易引起群体发病。本次通过对宁夏四地区的调查共发现12种艾美耳球虫，其中牛艾美耳球虫是宁夏部分地区的优势虫种。不同月龄的奶牛所感染的球虫种类也不一样，倪晓婷等[16]发现1～3月龄犊牛主要感染柱状艾美耳球虫、奥博艾美耳球虫和椭圆艾美耳球虫。本调查发现1～3月龄犊牛主要感染柱状艾美耳球虫、牛艾美耳球虫和邱氏艾美耳球虫。其中柱状艾美耳球虫的感染率最高，这与倪晓婷等[16]报道结果一致。在此次调查中发现，1～3月龄段的犊牛感染牛艾美耳球虫和邱氏艾美耳球虫的比例较高，这2种 艾美耳球虫致病性最强，对犊牛危害最大。本调查还发现，4～6月龄奶牛主要感染牛艾美耳球虫和皮利他艾美耳球虫，7～9月龄奶牛主要感染亚球形艾美耳球虫和牛艾美耳球虫，10～12月龄奶牛主要感染牛艾美耳球虫和亚球形艾美耳球虫，10～12月龄 奶牛球虫感染率最高，为62.07%，但是感染强度最大的是2～3月龄的犊牛，其平均OPG为6 277.44。成年奶牛对球虫具有较强的抵抗力，很少发病，一般呈隐性感染状态，可排出卵囊污染环境。蒋业慧等[14]在新疆奎屯地区的调查结果显示，1～2岁奶牛球虫的感染率最高，为39.72%，但2～3月龄犊牛的球虫平均感染强度最大，OPG为14 456。 张宽宽等[13]在新疆的规模化奶牛场的调查结果显示，7～12月龄奶牛的球虫感染率最高，为48.8%，小于2月龄的犊牛的平均OPG最大，为2 667.1。 赵其平等[17]在上海地区奶牛球虫的调查结果表明，0～2月龄犊牛的球虫感染率最大，为61.9%。这些调查结果均与本调查结果一致。因此，对于规模化奶牛场，球虫病主要危害1～3月龄犊牛，导致犊牛腹泻、脱水、被毛粗糙，甚至导致犊牛出现血便以及死亡，大于1岁的奶牛球虫感染率高，但感染强度低，大多都是球虫携带者，已获得自然免疫，但是奶牛会不断排出卵囊，增加了牧场的环境污染。临床型奶牛球虫病的发生主要和艾美耳球虫种类、摄入卵囊数量、感染奶牛月龄、继发感染以及牛场管理措施等因素有密切关系。1～3月龄犊牛的球虫感染率高，这与犊牛体质有关，犊牛出生后免疫功能不健全，抗病能力较差，瘤胃发育不完全，容易引起发病，成年奶牛身体的各项机能发育较完善，抵抗力较强。

总之，准确的诊断和流行病学调查是奶牛球虫病综合防治的关键环节。奶牛养殖场必须加强饲养管理，注重环境卫生；合理安排饲养密度，减少断奶、转群，分批进栏饲养；定期检测，掌握抗球虫药持效期，综合评估驱虫效果。