三种方法建立外伤性增生性玻璃体视网膜病变的兔模型研究*

陈 洁， 吴灵丹， 王资懿， 徐柒华

（南昌大学附属眼科医院，江西 南昌 330000）

外伤性增生性玻璃体视网膜病变（traumatic proliferative vitreoretinopathy，TPVR）是开放性眼外伤的一种常见的并发症，其本质是过度的眼内创伤修复反应，在视网膜前后形成具有收缩能力的纤维膜，最终牵拉视网膜造成视网膜脱离［1］。有研究显示，增生性玻璃体视网膜病变（proliferative vitreoretinopathy，PVR）的发生与多种细胞因子有关，其中血小板源性生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）和转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）与PVR 的发生密切相关［2-3］。富血小板血浆（platelet-rich plasma，PRP）中含有大量的血小板，血小板可以分泌多种细胞因子，比如PDGF 和TGF 等，这些因子可以促进细胞增殖和纤维形成，同时促进纤维向视网膜黏附，形成PVR模型。此外，视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）被认为在PVR 病理生理过程中起着关键作用［4］。本实验旨在观察玻璃体腔内注射PRP、RPE 以及TGF-β2在建立TPVR的兔模型的效果。

材料和方法

1 实验材料

1.1 实验动物及分组 清洁级健康青紫蓝兔24只，共48 只眼，雌雄各半，6～8 周龄，体重2.0～2.5 kg，由长沙市天勤生物技术有限公司提供，许可证号为SCXK（湘）2019-0015，均排除眼部疾病，所有操作对动物双眼进行。将动物随机分为4组，每组6只动物，12 只眼：实验组3 组，分别为PRP 组（玻璃体腔内注射0.3 mL PRP）、TGF-β2组［玻璃体腔内注射0.3 mL TGF-β2（50 μg/L）［5］］和RPE 组［玻璃体腔内注射0.3 mL RPE 细胞（1.5×109/L）［6］］，以及对照组（玻璃体腔内注射0.3 mL生理盐水）。

1.2 实验材料和仪器 RPE 细胞（上海钰博生物科技公司）；TGF-β2［批号：081701-1，派普泰克生物科技（苏州）有限公司］；盐酸丙美卡因滴眼液（爱尔康有限公司）；加替沙星眼用凝胶（沈阳兴齐眼药股份有限公司）；左氧氟沙星滴眼液（万汉制药有限公司）；氟米龙滴眼液（参天制药有限公司）；蛋白酶抑制剂（士德生物工程有限公司）；PBS（HyClone）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（南京诺唯赞生物科技有限公司）；SDS 裂解液（上海碧云天生物技术有限公司）；蛋白酶抑制剂混合物（北京普利莱基因技术有限公司）；α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）抗体［西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司］；GAPDH 抗体（诺伦生物科技有限公司）；Goat Anti-Rabbit IgG（武汉博士德生物工程有限公司）；PVDF膜（Promega）；ECL 免疫印迹（Western blot）检测试剂盒（Advansta）；眼球固定液（G1109，Servicebio）；眼底照相机［尼德克医疗器械贸易（上海）有限公司］；眼部B超机（Aviso）。

1.3 制备PRP 以注射器抽取兔耳动脉血5 mL，用含3.8%枸橼酸钠的玻璃离心管收集兔血（血与枸橼酸钠体积比为9∶1），轻轻摇动混匀；室温、211×g离心10 min；取上1/3 之上清液，进行血小板计数，获得的血小板密度为（1.9～2.8）×1011/L。

2 TPVR动物模型的制作

术前3 d，每只待手术的兔眼每天滴左氧氟沙星滴眼液4 次。术前用盐酸丙美卡因滴眼液对兔子进行表面麻醉。然后按以下步骤制备模型：开睑器开睑，聚维酮碘注射液冲洗术眼结膜囊，于颞上方角膜缘后5 mm 处，采用15°刀刺向玻璃体中心部，造成巩膜穿通伤，伤口长约3 mm，随后于角巩缘后3 mm 向各组玻璃体腔内注射相应药物。术毕结膜囊内涂加替沙星眼膏。术后1周内，每日4次给予术眼左氧氟沙星滴眼液及氟米龙滴眼液预防感染及抗炎。

3 临床观察

3.1 术后观察和PVR 分级 术后1、14、21 和28 d，术眼复方托吡卡胺散瞳后，用眼底照相和眼部B 超观察，记录各组兔眼玻璃体和视网膜改变并进行PVR分级（采用Fastenberg分级［7］，见表1）。

表1 Fastenberg分级Table 1. The Fastenberg classification

3.2 Western blot 检测玻璃体腔中α-SMA 的含量术后第28天，分别在各组中随机抽取3只动物，于角膜缘后4 mm处从不同的钟点位用7号针头从玻璃体腔内抽取玻璃体液0.5 mL，分别加入蛋白酶抑制剂135×g离心15 min 后，收集上清裂解液用于BCA 蛋白检测。等量的蛋白质在10%SDS-PAGE 凝胶上加载并分离，转移到PVDF 膜上。用5%脱脂牛奶在TBST 中室温封膜1 h，并与Ⅰ抗（α-SMA 和GAPDH抗体）在4 ℃孵育过夜；TBST 漂洗4 次，每次10 min；与Ⅱ抗在室温下孵育1 h；TBST 漂洗4 次，每次10 min；滴加ECL 发光液，用成像系统显影。使用成像软件（ImageJ）确定每个检测波段的综合强度，至少重复3次。

3.3 眼球的固定与切片 术后第28 天，实验组及对照组动物过量麻醉处死后，立即摘除眼球，分离干净后立即置于FSA 眼球固定液中3 d，梯度蔗糖溶液脱水，OCT 包埋冰冻切片，常规HE 染色、显微镜观察视网膜组织结构。

4 统计学处理

采用SPSS 22.0 软件对实验数据进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（mean±SD）表示。PVR分级采用等级资料的秩和检验；蛋白表达采用单因素方差分析（one-way ANOVA），用最小显著性差异法（LSD 法）进行事后检验来确定组间差异。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

结果

1 各组玻璃体及视网膜改变结果

通过眼部B超及眼底照相检查造模术后第28天各组兔眼，可观察到：PRP 组玻璃体混浊伴视网膜漏斗状脱离；TGF-β2组玻璃体浑浊，视网膜增生条索收缩，可见髓线扭曲抬高，视网膜脱离；RPE 组玻璃体混浊伴浅层视网膜脱离；对照组玻璃体轻度混浊，视网膜未脱离，见图1、2。

Figure 1. Fundus photography results on day 28 after traumatic proliferative vitreoretinopathy modeling. A：fundus photography showed vitreous opacities and retinal detachment in PRP group；B：fundus photography showed shrinkage of vitreoretinal proliferative cords，visible distortion and elevation of the medullary line，and retinal detachment in TGF-β2 group；C：fundus photography showed localized retinal detachment in RPE group；D：fundus photography showed localized traction in the vitreous body of control group，without significant retinal detachment.图1 外伤性增生性玻璃体视网膜病变模型术后28 d眼底照相结果

Figure 2. Ultrasound results of rabbit eyes on day 28 after traumatic proliferative vitreoretinopathy modeling. A: ultrasound showed vitreous opacity with retinal funnel detachment in PRP group；B and C:ultrasound showed vitreous opacity with superficial retinal detachment in TGF-β2 group and RPE group；D:ultrasound showed mild vitreous opacity and no retinal detachment in control group.图2 外伤性增生性玻璃体视网膜病变模型术后28 d眼底B超结果

2 各组PVR分级与平均级别比较结果

根据造模后第7、14 和28 天眼底检查情况，将各组实验动物依据Fastenberg 分级。在造模后第7 天，PRP 组0 级 有5 只 眼，1 级 有6 只 眼，2 级 有1 只 眼，TGF-β2组0级有7只眼，1级有5只眼，RPE组0级有6只眼，1 级有5 只眼，2 级有1 只眼，对照组0 级12 只眼；3 组实验组玻璃体混浊发生率与对照组相比，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 各组术后第7天PVR分级与平均级别情况统计Table 2. PVR grade and average grade statistics of each group on the 7th postoperative day（n=12）

在造模后第14 天，PRP 组0 级有2 只眼，1 级有4只眼，2 级有5 只眼，3 级有1 只眼，TGF-β2组0 级有4只眼，1 级有4 只眼，2 级有2 只眼，RPE 组0 级有3 只眼，1级有5只眼，2级有3只眼，3级有1只眼，对照组0 级10 只眼，1 级2 只眼；3 组实验组玻璃体混浊发生率与对照组相比，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表3 各组术后第14天PVR分级与平均级别情况统计Table 3. PVR grade and average grade statistics of each group on the 14th postoperative day（n=12）

在造模后第28 天，PRP 组2 级有2 只眼，3 级有3只眼，4 级有4 只眼，5 级有3 只眼，TGF-β2组0 级有1只眼，1 级有3 只眼，2 级有3 只眼，3 级有2 只眼，4 级有2 只眼，5 级有1 只眼，RPE 组0 级有1 只眼，1 级有2 只眼，2 级有3 只眼，3 级有3 只眼，4 级有2 只眼，5级有1 只眼，D 组0 级12 只眼；，3 组实验组玻璃体混浊发生率与对照组相比，差异均有统计学意义（P＜0.05）；PRP 组与TGF-β2组和RPE 组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表4。

表4 各组术后第28天PVR分级与平均级别情况统计Table 4. PVR grade and average grade statistics of each group on the 28th postoperative day（n=12）

3 玻璃体腔中α-SMA蛋白检测结果

术后第28 天各组间玻璃体腔中α-SMA 蛋白表达水平的差异有统计学意义（F=205.174，P＜0.05）；组间两两比较显示，PRP 组、TGF-β2组和RPE 组玻璃体中的α-SMA 蛋白表达水平均显著高于对照组（P＜0.05），见图3。

4 视网膜组织HE染色检查结果

术后第28 天，可见PRP 组与TGF-β2组视网膜各层排列紊乱，严重扭曲或局部断裂，各层结构不清晰，内界膜断裂，视网膜色素上皮层与神经上皮细胞分离明显；RPE 组视网膜各层排列扭曲，视网膜前可见增殖膜，牵拉视网膜；对照组视网膜各层结构清晰，排列尚整齐，未见明显视网膜脱离，见图4。

讨论

PVR 动物模型是PVR 防治研究的重要手段，现随着PVR 疾病的认知，已经超过25 种动物模型方法建立标志性的模型，包括经典的玻璃体腔注射细胞或细胞因子、手术操作等，都在不断发展［8-10］。PRP可以分泌多种细胞因子，最主要的是PDGF 和TGF，PDGF 的分泌和调节失衡对PVR 的病理过程起着重要作用，血清中高浓度的PDGF进入玻璃体腔和视网膜下，激活RPE 细胞，促使其发生迁移和增殖，最终形成增生膜，因此PRP 经常在建立PVR 模型中被使用［11］。在PVR 发生发展中，RPE 细胞的释放、增殖和分化是启动和促进增殖形成的最重要因素，而且RPE 细胞同时会自分泌PVR 过程中重要的细胞因子，因此有学者会采用注射RPE 细胞的方法建立PVR 模型［6］。TGF-β2因其在纤维化疾病（如肝硬化、肾硬化等）中具有促进组织收缩的作用［12］，在PVR发病机制的研究中得到很大的关注。在体外实验中，TGF-β2能刺激RPE 细胞发生上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）［13］；体 内 实 验中，TGF-β2注射到玻璃体腔后可引起兔眼PVR 的发生［14］。有研究表明，单纯制作兔眼眼球穿通伤可以形成PVR，但其实验周期长，需等待8～13 周［14］。目前的造模方法大多为单纯玻璃体注射或行玻切手术造成视网膜裂口，但是实验过程复杂或者结果不太理想，PVR 形成不显著，影响进一步的实验研究。所以探索一种更方便有效的PVR模型仍然显得非常必要。本研究采用外伤加玻璃体注药，实验效果更为显著。

Figure 3. Western blot analysis of α-SMA protein level in the lysates of rabbit vitreous body. Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs PRP group.图3 各组兔眼玻璃体中α-SMA的蛋白水平

Figure 4. HE staining of rabbit retinal tissues on day 28 after surgery（scale bar=50 μm）. A and B：in PRP group and TGF-β2 group，the retinal layers were disordered，severely distorted or locally fractured，the structure of each layer was unclear，the inner boundary membrane was broken，and the retinal pigment epithelium（RPE）was clearly separated from the neuroepithelium；C：in RPE group，the layers of the retina were distorted and the proliferating membrane was visible in front of the retina，pulling the retina；D：in control group，the structure of the retinal layers was clear，the arrangement was still neat，and no obvious retinal detachment was seen.图4 术后第28天兔眼视网膜组织病理变化

本实验研究显示，术后第28 天，PRP 组、TGF-β2组和RPE组中玻璃体腔内的α-SMA蛋白含量都高于对照组，表明对TPVR 都具有一定的促进形成作用。从PVR 分级中分析，术后第28 天实验组玻璃体视网膜增生程度高于对照组。视网膜组织病理学观察结果显示，实验组玻璃体视网膜增生程度也高于对照组。以上实验结果表明，在造成眼球外伤的基础上，PRP、RPE 和TGF-β2注射到玻璃体腔中均能有效地引起TPVR的发生发展。

在临床上，外伤造成的巩膜和视网膜伤口，相比于其他原因引起的PVR，TPVR 形成更加迅速，后果也更加严重［15-16］。有临床观点表明，PVR一直与视网膜裂孔相关联，但是单纯视网膜裂孔是不足以产生PVR 这种现象，需要细胞因子与炎症共同作用，所以我们给兔眼制造巩膜穿通伤产生炎症，并且破环血-视网膜屏障，使得RPE 细胞从Bruch 膜脱离，暴露于血清中的细胞因子，细胞间紧密连接破环并且丢失上皮细胞形态，使得RPE 细胞开始增殖、迁移，发生EMT，同时炎症细胞和成纤维细胞等迁入，使得RPE细胞和神经胶质细胞表达α-SMA、波形蛋白（vimentin），分泌细胞外基质的能力增强，最终在视网膜前后形成具有收缩能力的纤维膜［17-19］，导致视网膜脱离。此次实验结果中，术后第28 天，对照组玻璃体及眼底无明显异常，考虑原因首先是PVR 的发生发展是多因素多机制的复杂过程，其次是单纯兔眼穿通伤形成PVR缓慢［14］。相对于其他研究中单纯眼球穿通伤术后4 周有效建立PVR 模型［20］，本研究制作的伤口较浅，对眼内环境影响较小，可能是导致术后第28天未见明显PVR形成的因素之一。

在PVR 中，视网膜前膜细胞分泌的各种生长因子是EMT 的重要推动者，包括PDGF、结缔组织生长因子和TGF-β 等［21-23］。PRP 中血小板分泌多种细胞因子（比如TGF-β 和PDGF）促进RPE 细胞增殖、迁移、转化为成纤维细胞或肌成纤维细胞来模拟人PVR 发病。PDGF 是已知刺激血管内皮和平滑肌细胞增殖的细胞因子，且该因子被证明能够促进RPE细胞EMT，同时促进RPE细胞的增殖。有证据表明，牵引膜和视网膜裂孔形成发展的主要因素是PDGF，因为不受外源细胞的影响，目前认为注射PRP 进入玻璃体可以模拟人PVR 的一个过程，但是单纯注射导致PVR 的程度比较低，所以大部分学者都是通过联合其它方式和注射PRP来建立PVR模型。因此本实验中我们采用玻璃体腔注射PRP 同时联合制作巩膜外伤，PVR 效果明显。TGF-β（主要是TGF-β2）在PVR 患者玻璃体、视网膜下液和增殖膜中过量表达［24］，能促进RPE 细胞中Ⅰ型胶原合成，导致组织纤维化的发生，同时促进细胞外基质产生、组织修复及其成分的改变、细胞增殖，提高VEGF 表达，促进血管新生，推动RPE 细胞EMT 过程。因此TGF-β 诱导的RPE 细胞EMT 过程在PVR 的发生、发展和转归中起着重要作用。本实验中玻璃体腔注射TGF-β2造成的PVR 程度较PRP 组轻，一方面考虑PRP 可分泌多种细胞因子促进PVR 进展，另一方面考虑与青紫蓝兔PVR 模型中PVR 严重程度与玻璃体中TGF-β1含量升高有关，而与TGF-β2含量无关［25］。在PVR 中，RPE 细胞的EMT 过程是核心步骤，即经历EMT 的RPE 细胞获得成纤维细胞表型，增加增殖和迁移能力，从而促进纤维膜的形成。在EMT过程中，RPE细胞的间充质标志物，比如α-SMA 表达升高。RPE 细胞暴露于玻璃体中，是EMT的起始步骤，但缺少足够的EMT 驱动的生长因子，可能是此次实验中RPE 组的PVR严重程度也低于PRP组的原因。

综上所述，在造成兔眼球穿通伤的基础上，玻璃体腔内注射RPE、PRP 和TGF-β2均能造成TPVR，其中玻璃体注射PRP建模效果最明显。这为PVR的防治研究打下实验基础。