朝医麻黄定喘汤对OVA诱导的过敏性哮喘豚鼠模型HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路的影响*

朴 颖， 王重阳， 宋艺兰， 孟庆玲， 郑明昱，金丽娜， 李良昌， 延光海△

（1吉林省过敏性常见疾病免疫与靶向研究重点实验室，吉林 延吉 133002；2延边大学附属医院急诊科，吉林 延吉 133000；3延边大学医学院解剖学教研室，吉林 延吉 133002；4延边大学医学院朝医教研室，吉林 延吉 133002）

过敏性哮喘是一种常见的由嗜酸性粒细胞、肥大细胞、中性粒细胞等多种炎性细胞参与的慢性呼吸系统疾病，在全世界范围内具有较高的发病率。由于治疗困难，容易复发，该病严重威胁公众健康［1-2］。过敏性哮喘以慢性气道炎症、黏液高分泌、支气管平滑肌高反应性和气道重塑为主要特点［3-4］，其发病机制复杂，通常由各种过敏性物质触发，涉及多种免疫细胞和促炎因子。最近有实验证实哮喘的发生发展与高迁移率族盒蛋白1（high mobility group box protein 1，HMGB1）/Toll 样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）/核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信号通路的激活有着密切的联系［5］。HMGB1是由单核细胞、巨噬细胞和其他免疫细胞刺激后释放的一种高度保守的核蛋白。HMGB1 能够激活TLR4 受体，通过靶向髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）和NF-κB 进而导致下游炎症反应［6］。TLR4 是一种重要的免疫识别受体，能够促进细胞因子合成与释放，有助于炎症反应的产生，参与哮喘的进展［7］。目前治疗哮喘的方法主要基于吸入皮质类固醇、β2受体激动剂和茶碱类药物［8］。由于哮喘患者之间存在显著的差异性，使得临床治疗效果仍然不理想。本课题组前期研究已证实麻黄定喘汤（Mahuang-Dingchuan decoction，MHDC）有显著的抗炎作用，能够有效改善哮喘的临床症状［9-11］。本研究将继续探讨MHDC 抑制哮喘气道炎症的作用机制是否与HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路有关。

材料和方法

1 实验材料

1.1 实验动物 雄性清洁级无病原体豚鼠50 只，6～8 周龄，体质量（200±30）g，由延边大学医学部实验动物中心提供。实验前1 周，豚鼠在标准实验室条件恒温（20～22 ℃）、12 h 的光/昼循环条件下饲养。本研究得到延边大学医学院伦理委员会批准，所有实验程序都严格遵守《实验动物管理条例》进行。

1.2 药物 MHDC 由麻黄15 g、苦杏仁7.5 g、桑白皮5 g、黄芩5 g、麦冬5 g、桔梗5 g、莱菔子5 g、款冬花5 g 和白果20 枚组成。上述药物从北京同仁堂药店一并购齐，药液由延边大学药学院制备［12］。将9 种中药按比例混合，在10 倍体积的纯净水中浸泡30 min，大火煮20 min 转文火30 min；收集药液后药渣加10 倍体积的水同上方法继续煎煮；将2 次提取液过滤后混匀，旋转蒸发仪进行浓缩，制备成1 g/mL 的供试液备用。

1.3 试剂 卵清蛋白（ovalbumin，OVA；Sigma）；氢氧化铝溶液（Thermo）；BCA 蛋白浓度测定试剂盒、HE 染色试剂盒、PAS 染色试剂盒、Masson 染色试剂盒和Diff-Quik 染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）；HMGB1、TLR4、MyD88、NF-κB 和β-actin 抗体（北京博奥森有限公司）；辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的羊抗兔IgG 和HRP 标记的羊抗鼠IgG（Abcam）；白细胞介素4（interleukin-4，IL-4）、IL-5和IL-13 ELISA试剂盒及免疫组织化学试剂盒（长春百奥生物科技有限公司）；胶原酶A 和DNase I（Invitrogen）。

1.4 仪器 RM2015石蜡切片机（Leica）；TXD3细胞涂片离心机（广州泸瑞明仪器有限公司）；5415D型低温高速多功能离心机（Eppendorf）；欧姆龙压缩式雾化吸入器（大连医疗器械厂）；小型垂直电泳仪及电泳槽（Bio-Rad）；Cytation 5 多功能成像、全自动酶标仪（BioTek）；Cyto-FLEX流式细胞仪（Beckman Coulter）。

2 方法

2.1 动物分组及模型制备 将所有豚鼠随机分为5组：正常对照（control）组、模型组（OVA 组）、OVA+低剂量MHDC（low-dose MHDC，MHDC-L）组、OVA+高剂量MHDC（high-dose MHDC，MHDC-H）组和OVA+地塞米松（dexamethasone，DEX）组，每组10 只。参照文献方法建立动物模型［13］，方案总结如下：除control 组外，其余4 组豚鼠均于第1、8 天腹腔注射100 mg OVA 生理盐水溶解液，第16 天开始，豚鼠进行1% OVA 气溶胶雾化激发，每次持续2 min，隔天一次，连续2 周；control 组均用0.9%氯化钠溶液代替。激发前1 h，MHDC-L 组5 g/kg MHDC 灌胃，MHDC-H组20 g/kg MHDC 灌胃，DEX 组0.5 mg/kg DEX 灌胃，control组和OVA组用等体积0.9%氯化钠溶液灌胃，每天1次，持续2周。

2.2 行为学评估 最后一次OVA 雾化吸入后开始记录豚鼠行为学变化。观察雾化30 min内豚鼠抓鼻、挠痒及哮喘发作症状等行为学指标并评分：无抓鼻或挠痒动作计0分，抓鼻或挠痒出现1～3次计1分，4～6次计2分，7次及以上计3分；无哮喘症状计0分，出现轻微哮喘症状计3 分，出现呼吸急促、或呼吸频率显著加快或焦躁不安等哮喘症状计6分，出现严重呼吸困难如急促点头、腹式呼吸等哮喘症状计9分。

2.3 标本采集 末次激发24 h 后处死豚鼠，将豚鼠固定于解剖台上，进行气管切开，灌注1 mL 0.9%氯化钠溶液，反复抽吸3 次后收集支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF），4 ℃冰箱保存。开胸取豚鼠左肺下叶，放入4%甲醛中固定保存，部分右肺保存在-80 ℃冰箱备用。

2.4 BALF 中炎症细胞计数 用血球计数仪对BALF 中炎症细胞总数进行计算，后将BALF 于4 ℃、3000 r/min 离心5 min，沉淀细胞涂片经Diff-Quick 染色后进行炎症细胞分类及计数。

2.5 ELISA检测细胞因子 根据相应的ELISA试剂盒测定各组豚鼠血清及BALF 中IL-4、IL-5 和IL-13的含量，通过绘制标准曲线计算其浓度，实验步骤严格遵照说明书操作。

2.6 流式细胞术 将小块的小鼠肺组织放入6 孔板中，并向其中加入1 g/L 胶原酶A、1 500 U/L DNase I及0.025 mol/L CaCl2，对孵育5 h后获得的单细胞悬液进行流式检测。

2.7 肺组织病理学检查 将10%福尔马林固定后的左肺进行石蜡包埋，后切成0.3 μm 厚度的切片备用。分别进行HE、PAS 和Masson 染色观察气道周围炎性细胞浸润情况和杯状细胞黏液分泌情况。

2.8 免疫组织化学检测 切片置于60 ℃烤箱熔蜡，依次进行脱蜡、水化，然后置于加热100 ℃的抗体修复液中修复。滴加兔抗小鼠HMGB1多克隆抗体，在4 ℃冰箱孵育过夜。次日洗涤后滴加HRP 标记的山羊抗兔IgG，室温孵育，DAB 显影，苏木素复染，中性树脂常规封片。

2.9 Western blot 检测肺组织蛋白表达 右肺组织用RIPA 裂解液后匀浆提取组织蛋白，BCA 试剂盒进行蛋白定量，测定每个样品的浓度。经SDS-PAGE分离提取的20 μg 等量蛋白质并通过电印迹转移到硝酸纤维素膜上；5%脱脂牛奶常温封闭1 h 后分别加兔抗鼠HMGB1、TLR4、MyD88和NF-κB抗体4℃孵育过夜；次日常规洗膜后加入HRP 标记的山羊抗兔IgG，室温孵育2 h；洗膜后，用超敏ECL 发光试剂，根据ImageJ软件用半定量法对蛋白条带进行分析。

2.10 免疫荧光法检测 切片置于60 ℃烤箱熔蜡，依次进行脱蜡、水化，然后置于加热100 ℃的抗体修复液中修复；PBS 洗涤后滴加3%BSA 溶液封闭1 h，加入HMGB1 抗体（1∶200）4℃冰箱孵育过夜；次日洗涤后滴加羊抗鼠荧光Ⅱ抗（1∶200）孵育2 h，最后滴加DAPI染核。

3 统计学分析

采用SPSS 17.0 进行统计分析。所有数据都以均数±标准差（mean±SD）表示。组间均数比较采用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1 MHDC 对豚鼠行为及BALF 中炎症细胞计数的影响

与control组比较，OVA 组豚鼠的抓鼻、挠痒及哮喘发作程度显著增高（P＜0.01）；与OVA 组比较，OVA+MHDC-L 和OVA+MHDC-H 组豚鼠的抓鼻、挠痒及哮喘发作程度显著减轻（P＜0.01），见图1A。对各组BALF 中炎症细胞数量及分类进行统计，发现OVA组与control组相比，炎症细胞总数显著增多（P＜0.05），以嗜酸性粒细胞最为明显；与OVA 组相比，OVA+MHDC-L、OVA+MHDC-H 和OVA+DEX 组嗜酸性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞的增长均受到抑制（P＜0.01），MHDC与DEX疗效相似，见图1B。

2 MHDC对BALF中炎症细胞因子水平的影响

与control 组相比，OVA 组豚鼠BALF 中IL-4、IL-5 和IL-13 水平均显著升高（P＜0.05）；与OVA 组相比，OVA+MHDC-L、OVA+MHDC-H 和OVA+DEX 组BALF 中的IL-4、IL-5 和IL-13 水平均显著降低（P＜0.01），见图2。

3 MHDC对肺组织炎症细胞因子含量的影响

如图3 所示，与control 组相比，OVA 组豚鼠肺组织中代表Th1 型细胞因子的干扰素γ（interferon-γ，IFN-γ）水平显著下降，代表Th2型细胞因子的IL-4水平显著升高；与OVA 组相比，OVA+MHDC-L、OVA+MHDC-H 和OVA+DEX 组中IFN-γ 水平升高的同时IL-4水平降低。

Figure 1. Effect of Mahuang-Dingchuan decoction（MHDC）on behavior（A）and inflammatory cell count in the bronchoalveolar lavage fluid（BALF）of guinea pigs（B）.DEX：dexamethasone；EOS：eosinophils；NEU：neutrophils；LYM：lymphocytes；MAC：macrophages.Mean±SD. n=10.#P＜0.05，##P＜0.01 vs control group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs ovalbumin（OVA）group.图1 麻黄定喘汤对豚鼠行为及BALF 中炎症细胞计数的影响

Figure 2. Effect of Mahuang-Dingchuan decoction（MHDC）on inflammatory cytokines in the bronchoalveolar lavage fluid（BALF）of guinea pigs. DEX：dexamethasone；IL：interleukin. Mean±SD. n=10.#P＜0.05 vs control group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs ovalbumin（OVA）group.图2 麻黄定喘汤对豚鼠BALF中炎症细胞因子的影响

4 MHDC对豚鼠肺组织病理学表现的影响

HE 染色结果显示，与control 组相比，OVA 组支气管黏膜损坏，黏膜下层可见大量炎症细胞浸润，气道壁增厚明显，MHDC 和DEX 治疗明显减轻炎症细胞浸润；PAS 染色结果显示，OVA 组气道周围杯状细胞显著增多，黏液分泌增加，MHDC 和DEX 治疗有效降低阳性细胞计数，抑制黏液高分泌；Masson 染色结果显示，OVA 组气道周围胶原蛋白沉积显著，MHDC和DEX能显著改善气道胶原沉积，见图4。

Figure 3. Effect of Mahuang-Dingchuan decoction（MHDC）on interferon-γ（IFN-γ）and interleukin-4（IL-4）expression in lung tissues of guinea pigs. OVA：ovalbumin；DEX：dexamethasone.图3 麻黄定喘汤对豚鼠肺组织中IFN-γ和IL-4表达的影响

5 MHDC 对豚鼠肺组织HMGB1、TLR4、MyD88和NF-κB蛋白表达的影响

Western blot结果显示，与control组相比，OVA组豚鼠肺组织中HMGB1、TLR4、MyD88 和NF-κB 蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）；与OVA 组相比，OVA+MHDC-L、OVA+MHDC-H 和OVA+DEX 组HMGB1、TLR4、MyD88 和NF-κB 蛋白表达均有不同程度的下降（P＜0.05 或＜0.01），其中OVA+MHDC-H 和OVA+DEX 组下降最为显著，见图5A。免疫组织化学染色结果可见，HMGB1 胞质内阳性表达呈棕黄色，OVA组HMGB1 蛋白在气道周围聚集明显，OVA+MHDCL、OVA+MHDC-H 和OVA+DEX 组气道周围HMGB1蛋白的聚集均不同程度地减少，见图5B。免疫荧光结果同样提示，与control 组相比，OVA 组HMGB1 荧光强度增强，经治疗后，MHDC-L、MHDC-H 和DEX组HMGB1荧光强度减弱，见图5C。

Figure 4. Effects of Mahuang-Dingchuan decoction（MHDC）on inflammation and fibrosis of lung tissues in the guinea pigs（×200）.OVA：ovalbumin；DEX：dexamethasone.图4 麻黄定喘汤对豚鼠肺组织炎症和纤维化的影响

讨论

过敏性哮喘是一种常见的由空气过敏原如尘螨、真菌等引发的气道炎性疾病，该病严重影响患者的日常生活，很多患者在接受治疗后哮喘仍然反复发作，从而发展成难治性支气管哮喘［14］。由于目前治疗哮喘药物的局限性，我们仍然需要探索更有效的治疗药物。朝医学认为，人体阴阳属性的不同和天禀脏理的偏颇是疾病发生的根本原因。《东医寿世保元》有云“人稟脏理有四不同……肝大而肺小者，名曰太阴人”。太阴人吸入气液之中下焦肝部发达，肺部孤弱，又太阴人多喜食肥甘厚味，欲静而不欲动，肺直而伸之功减弱，易聚湿生痰，故太阴人更易感受外邪引动伏痰，发为哮喘。因此基于四象医学理论，研究和开发针对于哮喘的治疗药物有十分重要的意义。

CD4+辅助性T 淋巴细胞（Th 细胞）在免疫功能障碍中发挥关键作用，直接参与哮喘的发生发展过程［15］。当机体遇到外界刺激时，Th细胞被激活，形成效应细胞亚群，主要包括Th1 和Th2 细胞，而Th1 和Th2 细胞的平衡在细胞和体液免疫应答的调节中起主要作用。当Th1/Th2 细胞分化平衡被打破，Th1 亚群分泌的IFN-γ 以及Th2 亚群分泌的IL-4、IL-5、IL-13 也表现为炎症细胞因子分泌失衡，其中IL-4 和IL-5 调节骨髓中嗜酸性粒细胞的成熟和释放，IL-13 促进B 细胞分化，在气道炎症、气道高反应性和黏液分泌中起主导作用，这些炎症细胞因子都是哮喘发病的关键因素，也是导致持续炎症反应和气道重塑的直接效应介质［16-17］。本研究发现，OVA 诱导的哮喘豚鼠BALF 中炎症细胞计数及IL-4、IL-5 和IL-13 水平显著升高，流式细胞术检测到OVA 诱导的哮喘豚鼠肺组织中IFN-γ 水平降低而IL-4 水平升高，HE、PAS 和Masson 染色可见豚鼠气道炎症细胞浸润加剧，黏液分泌及胶原蛋白沉积增多；经MHDC 治疗后，豚鼠BALF 中炎症细胞计数及IL-4、IL-5 和IL-13水平降低，肺组织中IFN-γ 水平升高而IL-4 水平降低，HE、PAS 和Masson 染色可见豚鼠气道炎症减轻，黏液分泌及胶原蛋白沉积减少。这些结果表明，MHDC可以有效缓解哮喘气道炎症的进展。

HMGB1 是一种重要的内源性促炎因子，广泛存在于细胞核和细胞质中，当发生感染时，HMGB1 刺激单核细胞和巨噬细胞分泌炎症介质，在炎性疾病的发病过程中起着至关重要的作用［18］。TLR4 是TLR 家族成员之一，是HMGB1 诱导炎症的重要受体，HMGB1 通过与TLR4 结合发挥其促炎作用［19］。TLR4 主要由富含亮氨酸的胞外段、跨膜段及含有Toll/IL-1 受体（Toll/IL-1 receptor，TIR）结构域的胞内段三部分组成，多在T 细胞、巨噬细胞和内皮细胞上表达。TLR4能够直接识别外源性的病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular pattern，PAMP）和内源性的损伤相关分子模式（damage-associated molecular pattern，DAMP）［20］。当TLR4 由脂多糖、透明质酸等一系列配体触发后，通过MyD88 依赖性和非依赖性方式激活NF-κB，诱导免疫和炎症反应［21］。Meng 等［22］发现，脂多糖诱导的过敏性气道炎症通过激活肥大细胞中的TLR4 而介导Th2 应答。TLR4 能够激活下游NF-κB 通路，促进基因转录和多种炎症介质表达。NF-κB 的激活能够促进Th2 细胞浸润及增加炎症细胞的沉积，同时释放多种炎症细胞因子［23］。本研究结果显示，OVA 诱导肺组织HMGB1、TLR4、MyD88 和NF-κB 蛋白表达上调；使用MHDC治疗后，肺组织中HMGB1、TLR4、MyD88和NF-κB蛋白表达下调。

Figure 5. Effects of Mahuang-Dingchuan decoction（MHDC）on the protein expression levels of high mobility group box protein 1（HMGB1），Toll-like receptor 4（TLR4），myeloid differentiation factor 88（MyD88）and nuclear factor-κB（NF-κB）in lung tissues of the guinea pigs. A：Western blot was used to detect the protein expression of HMGB1，TLR4，MyD88 and NF-κB；B：the expression of HMGB1 protein detected by immunohistochemistry（×200）；C：the expression of HMGB1 protein detected by immunofluorescence（×200）. DEX：dexamethasone. Mean±SD. n=10.##P＜0.01 vs control group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs ovalbumin（OVA）group.图5 麻黄定喘汤对豚鼠肺组织HMGB1、TLR4、MyD88和NF-κB蛋白表达的影响

综上所述，MHDC 能有效降低哮喘豚鼠肺内炎症细胞总数和炎症因子水平，缓解肺内炎症细胞浸润，抑制杯状细胞增生，逆转胶原蛋白沉积并减轻哮喘豚鼠气道炎症，其作用机制可能与抑制HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路有关。