石斛属植物SSR分子标记的研究进展

彭 婵，张新叶，刘宗坤，马林江，陈慧玲

（1黄冈师范学院/经济林木种质改良与资源综合利用湖北省重点实验室/大别山特色资源开发协同创新中心，湖北黄冈 438000；2湖北省林业科学研究院，武汉 430075；3湖北宗坤石斛科技开发有限公司，湖北英山 438700）

0 引言

石斛属(Dendrobium)为兰科(Orchidaceae)第二大属，全球约1500多种，广泛分布于亚洲热带、大洋洲和澳大利亚等地区[1]。中国约有81种2变种，其中霍山石斛(Dendrobium huoshanense)、铁皮石斛(D.officinale)等18种为国内特有种[2]。石斛属植物按功能通常分为观赏石斛和药用石斛[3]，其中观赏石斛是最受欢迎的盆栽植物之一[4]，具有独特的花形和花香[5]，被广泛用于切花、盆花[6]的生产。药用石斛在中国始载于秦汉时期的《神农本草经》[7]，此后许多古代药典均有记载，其具有补五脏虚劳、养肾气、益力等功效，现代医学研究证明石斛属植物富含多糖、生物碱、黄酮苷等各类有机物，具有降糖[8]、降脂[9]、抗氧化[10]、护肝肾[11-12]、改善高血压[13]、抗肿瘤[14-15]等作用，在许多疾病的治疗上应用潜力巨大，系《中国药典》国家基本药物名录收载品种，2020年1月6日又被国家卫健委列入《党参等9种试点按照传统既是食品又是中药材的物质名单》[16]，由于石斛属植物具有重要的经济价值，其野生资源遭到过度采挖甚至濒危，利用分子生物学技术对石斛开展遗传学研究对其物种保护与种质资源利用意义重大。

目前被开发并且应用在石斛属中的遗传标记有RAPD[17]、ISSR[18]、SRAP[19]、SSR[20]、TRAP 和 SCAR[21]等，其中SSR标记因变异度、灵敏度高、重复性好、操作简单等优点，被作为国际植物新品种保护联盟(UPOV)新品种DUS测试的理想标记[22]，也被成功应用于重要经济林木非法砍伐执法举证[23]等各类植物研究中。SSR标记对于石斛属主要应用在遗传多样性与亲缘关系研究、种质资源的鉴定、遗传图谱和指纹图谱构建、种质资源与纯度鉴定等方面。笔者以近年来SSR标记在石斛属中的研究与应用为中心进行综述，以期为今后SSR标记在石斛属中的深入应用提供参考。

1 遗传多样性研究

Gu[24]和Fan[25]等应用磁珠富集法分别设计出铁皮石斛和流苏石斛(D.fimbriatum)的SSR标记引物并检测到高水平遗传多样性，哈温平衡和连锁不平衡计算证明这些引物标记在石斛种群水平上有应用潜力。通常遗传多样性越高的物种其稳定性与进化潜力越大，石斛属植物是重要的中药材，在国内其野生资源面临逐年减少或枯竭的危险，针对遗传多样性制订相应的保护和利用策略对于石斛属资源开发具有重要意义。近年来利用SSR标记技术进行石斛野生资源遗传多样性研究有一些报道，如Cai等[26]研究了粉花石斛9个野生居群96个个体，发现其具有较高遗传多样性，推测认为导致野生粉花石斛(D.loddigesii)群体显著减少的原因非自身遗传基础而是人为破坏。Yan等[27]研究中国东南地区野生金钗石斛(D.nobile)发现了较高的遗传多样性，7个SSR标记检测出平均观察等位基因范围为0.53～0.79，平均期望杂合度范围为0.64～0.9，但海南岛居群较大陆居群的遗传多样性低而遗传分化度高，可能面临濒危风险。郑基阳等[28]利用12对引物检测安徽霍山县野生霍山石斛居群24份样品，平均等位基因数为5.4，平均观察杂合度为0.500，平均预期杂合度为0.638，分析结果认为该种群可能存在近亲繁殖现象，此后Wang[29]对霍山石斛自然居群的研究结果也与之相似。Hou[30]比较了浙江、福建、云南铁皮石斛野生居群个体和种质资源库样本的遗传多样性差异，发现野生居群等位基因多样性高于资源库样本，但资源库样本所含稀有等位基因数高于野生居群。袁英惠[31]对球花石斛5个居群共136个球花石斛(D.thyrsiflorum)个体遗传多样性和遗传结构进行了研究，探讨了野生球花石斛日益减少的内在原因，为其野生资源的保护、药材的道地性和合理开发利用提供了科学依据。

2 亲缘关系研究

国内石斛属植物自然分布区广泛，种质资源的亲缘关系与其地域分布之间是否存在相关性有待证实。蔡小彦[32]利用SSR和SRAP标记研究国内东南地区9个粉花石斛野生居群，2种标记结果均显示居群间的遗传距离和实际的地理距离没有明显相关性。此后较多关于铁皮石斛的研究结果则呈两极趋势，如徐蕾等[33]研究来自云南、浙江等地36个铁皮石斛野生和栽培居群，大多数来自不同区域的铁皮石斛被分在同一类群中，同一种源地的铁皮石斛反被分在了不同的类群，种质的亲缘关系与种源地之间无直接联系。肖冬长等[34]在8个铁皮石斛品种的分析也显示种源之间亲缘关系和种源地联系并不紧密，认为亲缘关系最近的云南黑节柴杆和云南广南软脚可能与其多糖含量有关。而赵瑞强[35]研究与前者来源地相似的17个铁皮石斛居群则发现种质间亲缘关系与其地理纬度具有显著的相关性，同时用SCoT标记也印证了该结果。董晓曼等[36]基于SSR多态性标记将滇、皖产区11个铁皮石斛人工栽培居群分为3个类群，聚类结果显示地理位置相近的居群遗传基础相对接近，有明显的种源地的地源性亲缘关系。余文霞等[37]对铁皮石斛9个产地29个居群聚类得到4个类群，各类群表现出较好的地域相关性，地理位置相近或生长地貌相似的居群遗传相似度较高。张雅琼等[38]通过聚类恰好把云南铁皮石斛栽培变异种与野生种能区分开，也证实亲缘关系与其地理种源具有显著的相关性。综上推测石斛种质亲缘关系表现与来源地非简单相关，或者也受检测群体数量以及栽培或野生型影响。

3 遗传连锁图谱的构建

分子标记遗传连锁图谱是进行植物基因组结构分析和比较研究的重要手段，也是研究优良基因定位的基础，石斛遗传连锁图的构建报道较少，主要是遗传背景方面的研究还不够深入，目前石斛遗传图谱构建研究以多标记联合作图为主。汪尚[39]以铁皮石斛为母本、以钩状石斛(D.aduncum)为父本进行杂交，获得石斛的140个作图群体F1代，并利用SRAP和SSR标记绘制了石斛简易遗传图谱，157个标记构成27个连锁群，总图距1580.4 cM，最长的连锁群为176.9 cM，最短的连锁群为6.6 cM，平均图距11.89 cM。潘宏兵[40]选出10对SSR、9条ISSR和67对SRAP多态性引物用于石斛F1作图群体的遗传性状分离分析，构建了含26个连锁群的石斛遗传图谱，230标记位点被定位，图距总长度为1548.9 cM，连锁群总长度2230.12 cM。任羽[41]采用“双假测交”作图策略，利用SSR、SRAP、RSAP和ISSR标记进行了石斛兰遗传图谱构建研究，该图谱包括29个连锁群，总图距为1421 cM，标记间平均图距为9.56 cM，连锁群总长度为1842 cM。

4 DNA指纹图谱构建

国内石斛品种多样，某些品种可能形态极为相似，且长期生长在相同和相似环境下的不同品种，在适应环境的过程中也会出现某些外观趋同的现象，但其生物学特性、药用成分和保健功效却可能千差万别，使用传统的形态学等方法在鉴别区分上具有局限性，DNA指纹图谱技术则为评价石斛真实性和证明产品质量一致性的有效方法。董晓曼等[36]利用32对SSR引物为11个滇皖铁皮石斛居群建立了唯一能够区别于其他供试材料的指纹图谱代码，为今后铁皮石斛的品种鉴定提供准确、可靠的方法及溯源信息平台。余文霞等[37]利用4对SSR引物构建了铁皮石斛所有主产区309份样品的SSR指纹图谱，可对铁皮石斛进行快速种质溯源。刘士辉等[42]对各地搜集的10个表现优良的石斛品种进行指纹图谱鉴定构建，从扩增出的59条特征条带中选择了11条谱带把供试材料完全区分开，为产量高、质量优的品系培育奠定了基础。张志勇[43]对冠豸山铁皮石斛5个野生种源和7个野生种自然杂交后代进行了SSR分析并构建了DNA指纹图谱，该图谱能够对冠豸山铁皮石斛资源进行有效区分。

5 种质资源鉴定

种质资源鉴定是植物品种保护和新品种定向培育的基础。赵庭梅等[44]利用7对SSR标记引物研究铁皮石斛、叠鞘石斛和金钗石斛共32份材料，发现SSR标记条带差异的基因型分型结果与石斛种内材料的表型差异存在一定的相关性。任羽等[45]通过UPGMA法进行聚类将28份石斛兰种质分为5类，聚类结果与其花色表现出较为密切的关系，能很好地从分子水平上揭示石斛兰品种的遗传背景、亲缘关系，为合理利用石斛兰种质资源培育有更高观赏价值的石斛兰新品种提供理论依据。张雅琼[38]基于SSR标记检测和UPGMA聚类，发现云南省铁皮石斛主产区的9个无性变异分属于普洱和文山州等3个不同的种源居群。韩晓霞等[46]对5个实生群体的100株铁皮石斛进行了遗传分析，发现5个石斛实生群体可能来自2个同源基因库。章竞子[47]以铁皮石斛、细茎石斛(D.moniliforme)、齿瓣石斛(D.devonianum)为研究对象，利用SSR标记成功将3个物种划分为3个类群实现种间鉴别。袁英惠[31]在14对微卫星引物数据基础上，对国内药材市场上球花石斛12个加工样品“黄草石斛”的地理来源进行鉴别，GeneClass 2.0和Structure 2.2 2个软件得出实验结果一致，说明SSR标记应用在种质资源鉴定上具有真实性和可信度。Zhao等[20]构建了铁皮石斛、粉花石斛和铜皮石斛的系统发育树，确认了物种及其变种的多样性，并发现部分SSR引物可用于石斛种内遗传变异鉴定。

6 种质纯度鉴定

杂交种或组培苗的纯度鉴定通常依据表型判断，需要在物种特定的种植季节进行，并且易受气候、生长条件等环境和人为不确定因素影响，而SSR标记技术则具有操作简单、准确性高、检测重复性好、实验稳定性高等优点。谢明璐等[48]将13对种间通用性SSR引物用于铁皮石斛种质纯度鉴定和真实性判别，其中4对能够检测铁皮石斛组培苗的种质纯度，确定在500株中有497株是同一种质品种，其他3株为机械操作导致的混杂株，品种纯度为99%。丁鸽等[49]从10对引物中筛选了3对引物用于晶帽石斛(D.crystallinum)组培苗的纯度鉴定，300株组培苗中298株带型完全相同为同一种质，品种纯度为99.3%。谢小波等[50]在开展铁皮石斛原球茎辐照诱变研究中，利用SSR标记检测到原球茎部分经辐照发生了DNA水平变异，且变异发生程度与辐射剂量存在一定正相关，真实反映了SSR标记可以用于检测突变性状后代遗传变异情况。李永清等[51]也验证了通过2对SSR标记可以成功区分铁皮石斛母本与子代。SSR分子标记也可有效应用于石斛杂交子代真实性鉴定。李永清[52]采用3对SSR标记鉴定铁皮石斛和霍山石斛正反交F1代植株，63个子代在正反交真杂种率分别为78.1%和90.3%。刘玉洋[53]对131个铁皮石斛和金钗石斛杂交F2代进行鉴定，真杂交种占杂交群体的91%。王培育等[54]鉴定铁皮石斛与金钗石斛杂交F1代和回交后代的真杂种率分别为78.6%和38.9%。

7 展望

SSR分子标记具有较低的检测和应用成本、高灵敏度与辨别力、在相近物种中可转移等优点，是遗传基础理论研究如遗传多样性、基因流量、系统进化等的重要工具，因其是在基因水平上研究植物多样性和遗传关系，不受环境因素影响，也是分子辅助育种，如亲子关系分析、杂交测试、连锁图谱构建、QTL分析、品种指纹图谱等不可或缺的手段。目前SSR标记在石斛属种质鉴定、遗传作图、遗传多样性和亲缘关系等方面有一些研究，帮助人们初步了解石斛的相对遗传关系，揭示物种的濒危状况，有利于资源保护和可持续利用。但与拟南芥等模式植物相比仍有不少的差距，以下是笔者从开发范围、开发深度与标准化应用3个方面总结本研究领域应继续完善以及还未解决的问题：（1）国内石斛属划分为13个组，目前已有文献记载的SSR标记研究对象主要集中于石斛组中铁皮石斛、霍山石斛、粉花石斛等具有药用价值的种类，而对于其他组和其他种的研究相对较少或仍处于未知阶段，后期应对不同组别与种类的石斛属植物进行标记开发与分析，积累更多的遗传数据与测试技术，从而更好地应用于石斛属的遗传多样性研究。（2）现已开发的SSR标记位点较少，虽然位点多态性较高，但获得的遗传信息仍然不足以覆盖石斛的全基因组，以致遗传分析结果所反映出的种群遗传结构信息出现偏差，基于此构建的遗传图谱分辨率较低，限制了石斛属植物QTL研究深入，难以发掘目的性状关联基因。目前已有少数高通量数据用于石斛属SSR标记开发，随着测序技术的发展与成本的不断降低，可以利用最新第三代以纳米孔测序为代表的单分子实时DNA测序技术批量开发更丰富的SSR标记，构建高密度遗传图谱，并发掘与石斛活性多糖、石斛碱等重要经济性状紧密连锁的分子标记，实现生长性状的精确定位。（3）石斛属种内变异多，不同种质资源在化学成分和药理活性上也存在差异，市场上以次充好的现象屡现。传统石斛种质鉴定多为形质与生化标准，部分研究已开展石斛种质资源的分子指纹图谱构建，但现阶段仅2018年霍山石斛鉴定颁布了分子鉴定地方标准，缺少支撑产业的国家性标准，其他众多石斛品种的分子检测标准还处空白，产品质量及安全性难以保证，因此，建议广泛开展石斛品种特异性SSR位点开发，并由国家相关部门及早制定国家标准或者行业标准，从特异性引物序列、不同制品DNA提取、PCR扩增与产物检测、数据采集、判定标准等各个环节进行统一管理，使该检测手段形成行业规范。