羊奶粉对小鼠免疫调节功能作用的研究

2022-05-30石韶琦逄金柱赖必辉

中国奶牛 2022年5期

石韶琦，逄金柱，赖必辉

（1.中国农业大学营养与健康系，北京 100191；2.内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司，呼和浩特 011500）

机体免疫力指机体抵抗外来侵袭、维护体内环境稳定性的能力，是机体识别和排除“异己”的生理反应[1]。环境影响和营养不良导致免疫稳态丧失，过去通过服用营养药物重建免疫平衡，如今，营养食品代表了一种保护、平衡或增强哺乳动物免疫系统的创新方法[2]，各种乳制品成为深入研究的对象[3]。

羊奶营养丰富[4]，具有提高消化率、促进生长发育、低致敏[5]、抗炎[6]、易消化吸收[7]、增强免疫力[8]等功能。研究表明，在HIV阳性患者摄入羊奶3个月后，CD4+细胞数量增加，免疫系统得到加强[9]。Jirillo等发现羊奶能够通过单核细胞和PMN释放NO激活先天免疫，并通过诱发IL-10、TNF-α等细胞因子的产生激活先天免疫和适应性免疫[10]。然而，羊奶粉等乳制品是否仍具有调节免疫功能尚缺乏充足的证据。

本研究利用健康小鼠模型，通过研究羊奶粉对小鼠细胞免疫、体液免疫和NK细胞活性等方面的影响，评价羊奶粉的免疫调节功能，为羊奶粉的开发与应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品

羊奶粉，由内蒙古欧世蒙牛乳制品有限责任公司提供，主要成分为全脂羊奶粉、脱盐乳清粉、浓缩乳清蛋白粉等。

1.1.2 试验动物

Balb/C小鼠，雄性，体重18～22g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。饲养条件为12h光照交替，洁净度SPF级，湿度维持在45%～50%，温度保持在20±2℃。小鼠可自主摄食及饮水，活动自由。

1.2 试验设备

酶标仪（Biotek, ELX808）；超净工作台（新加坡ESCO公司）；CP21GⅡ高速冷冻离心机（日立公司）；恒温培养箱（37℃、43℃）；G560E漩涡混合器（美国SCIENTIFIC Instruments公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 试验动物分组及处理

将48只Balb/C健康小鼠随机分成空白对照组、低剂量组和高剂量组，每组各16只。空白对照组灌胃生理盐水，低剂量组和高剂量组分别按每千克体重6.25g、12.5g的剂量灌胃羊奶粉，每日灌胃0.2mL，连续45d。

1.3.2 血清样本制备

摘取小鼠眼球采血，室温下静置2h，于4℃条件下1 000r/min离心10min，收集血清，-20℃保存。

1.3.3 脾淋巴细胞悬液制备

小鼠处死后在无菌条件下取脾脏，置于盛有Hank's液的平皿中，轻轻磨碎脾脏，制成单个细胞悬液。经200目筛网过滤，于1 000r/min条件下离心10min，用Hank's液洗2遍，最后将细胞悬浮在5mL RPMI-1640培养液中。

1.3.4 补体制备

采集豚鼠血，混合5只不同豚鼠血清，将1mL压积绵羊红细胞（SRBC）加入到5mL豚鼠血清中，4℃放置30min，振荡，离心取上清，分装，-70℃保存，用时以SA缓冲液1:8倍稀释。

1.4 测定指标

1.4.1 体重及脏器/体重比

动物按照分组灌胃给予生理盐水和低、高剂量羊奶粉，所有组连续灌胃45d。实验第0天第一次灌胃前称量小鼠初始体重并记录，实验第45天称量小鼠最终体重后，摘取胸腺和脾脏称重并记录，计算胸腺/体重比值和脾脏/体重比值。

1.4.2 脾淋巴细胞增殖能力检测

刀豆蛋白A（concanavalin A，ConA）诱导动物脾淋巴细胞转化，利用MTT试剂盒对淋巴细胞悬液进行测定，在490nm波长下检测吸光值（OD值）。通过式（1）表示淋巴细胞的增殖能力。若受试样品吸光值差值显著高于对照组(P＜0.05)，判定为阳性。

1.4.3 迟发型变态反应（DTH）

腹腔注射0.2mL 2%（v/v）SRBC悬液，免疫4d后，测量左后足跖部厚度，然后在测量部位皮下注射20μL 20%（v/v）SRBC，注射后于24h测量左后足跖部厚度，同一部位测量三次，取平均值，以此来表示DTH程度。

1.4.4 抗体生成细胞测定

腹腔注射0.2mL 2%（v/v）SRBC悬液，免疫4d后，解剖小鼠获得脾细胞悬液，并将其与琼脂糖培养基、10% SRBC（v/v）混合倾倒在玻片上，加入稀释后的补体温育1h，计数溶血的空斑数。

1.4.5 血清溶血素（HC50）测定

腹腔注射0.2mL 2%（v/v）SRBC悬液，免疫4d后，解剖小鼠收集血清，SA缓冲液稀释200倍，取稀释后的血清50μL加入反应板再加入25μL SRBC悬液、50μL补体混匀。37℃恒温培养箱中保温30min，冰浴终止反应，1 500r/min条件下离心10min。样品孔和空白对照孔各取上清液50μL加入96孔培养板内，加都氏试剂150μL。半数溶血孔加入12.5μL 10%（v/v）SRBC，再加都氏试剂至200μL。震荡器充分混匀，放置10min，于540nm处用全自动酶标仪测定各孔光密度值。小鼠血清溶血素由式（2）表示。

1.4.6 自然杀伤细胞（NK细胞）活性测定

将脾脏分离出的NK细胞与YAC-1淋巴瘤细胞各100μL共同培养，采用WST-8试剂盒法检测NK细胞活力。若受试样品的NK细胞活力显著高于对照（P＜0.05），判定为阳性。

1.5 数据处理

应用SPSS 20.0进行统计学处理，结果以平均值±标准差表示，组间均数比较采用t检验，P＜0.05为差异显著，具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 羊奶粉对小鼠体重及脏器/体重比的影响

羊奶粉对小鼠体重影响如图1A所示，灌胃45d后，各组小鼠体重随着灌胃时间延长而增加，低剂量组和高剂量组与空白对照组相比，无显著差异（P＞0.05）。羊奶粉对胸腺/体重比值的影响如图1B所示，灌胃45d后，低剂量组和高剂量组与空白对照组相比无显著差异（P＞0.05）。对脾脏/体重比值的影响如图1C所示，低剂量组和高剂量组与空白对照组相比无显著差异（P＞0.05）。由此表明，羊奶粉对小鼠体重及脏器/体重比无显著影响。

图1 羊奶粉对小鼠体重、脏器的影响

2.2 羊奶粉对小鼠细胞免疫功能的影响

细胞免疫涉及T淋巴细胞及其产物（淋巴因子），ConA诱导淋巴细胞转化和DTH反应需要激活的T淋巴细胞对给定抗原的特异性识别，从而增殖和释放细胞因子，淋巴细胞增殖能力和DTH反应体现了细胞因子诱导巨噬细胞募集和激活的能力[11]。

T细胞是获得性免疫中细胞免疫的重要效应细胞，在自身免疫、肿瘤免疫、移植物排斥反应等方面起着重要作用[12]，脾淋巴细胞中的T细胞在ConA的刺激下增殖，增殖程度反映T细胞的活性[13]。羊奶粉对小鼠脾淋巴细胞转化能力的影响如图2所示，灌胃45d后，与空白对照组相比，羊奶粉低剂量组脾淋巴细胞转化能力未显著增加（P＞0.05），高剂量组淋巴细胞转化能力显著增加（P＜0.05）。由此表明，羊奶粉可促进脾淋巴细胞转化能力。

图2 羊奶粉对小鼠脾淋巴细胞增殖能力的影响

DTH是由特异性致敏T细胞介导的细胞免疫反应[14]，是一种以单核细胞浸润及细胞变性坏死为主要特征的炎症反应，该反应可作为判定机体细胞免疫功能的指标[15]。羊奶粉对小鼠DTH的影响如图3所示，与空白对照组相比，羊奶粉低剂量组和高剂量组DTH水平显著提高（P＜0.05），表明羊奶粉可以增强细胞免疫反应。

图3 羊奶粉对小鼠迟发型变态反应的影响

2.3 羊奶粉对小鼠体液免疫功能的影响

抗体生成细胞被认为是体液免疫反应的重要组成，其产生大量抗体，在宿主防御炎症和维持体内平衡方面实现一系列功能[16]。羊奶粉对小鼠抗体生成细胞的影响如图4所示，与空白对照组相比，羊奶粉低剂量组和高剂量组显著增加（P＜0.05），表明羊奶粉可增强小鼠体液免疫反应。

图4 羊奶粉对小鼠抗体生成细胞的影响

溶血素是一种能特异性结合红细胞的抗原型灵敏的互补固定抗体，该抗体可导致红细胞溶解释放出血红蛋白，血清中溶血素水平越高表明机体体液免疫水平越高，其可用来评价机体体液免疫状态[17]。羊奶粉对小鼠血清溶血素的影响如图5所示，羊奶粉低剂量组和高剂量组血清溶血素水平均高于空白对照组，但均无显著差异（P＞0.05）。

图5 羊奶粉对小鼠血清溶血素的影响

2.4 自然杀伤细胞（natural killer cells，NK细胞）活性测定

NK细胞是关键的先天免疫细胞，可以被激活以介导细胞毒性活性，并产生高水平的细胞因子和趋化因子，参与非特异性抗病毒防御机制[18]，其在增强先天免疫反应和激活适应性免疫系统方面发挥重要作用[19]。羊奶粉对小鼠NK细胞活性的影响如图6所示，低剂量组和高剂量组NK细胞活性均呈上升趋势，但与空白对照组相比，两试验组NK细胞活性未显著增加（P＞0.05）。