红茶菌酸菜发酵条件的优化

刘庆静，赵平，郭莹莹，邹积宏*，窦清泉

（1.黑龙江大学农业微生物技术教育部工程研究中心，黑龙江哈尔滨 150500）（2.黑龙江大学生命科学学院,黑龙江省普通高校微生物重点实验室,黑龙江哈尔滨 150080）（3.黑龙江省质量监督研究院，黑龙江哈尔滨 150050）

白菜是我国产量大且营养价值丰富的农产品之一[1]。随着人们不断追求营养价值高而且美味食品的同时，酸菜逐渐受到广大群众的欢迎与热爱。这样既能延长白菜的贮藏时间，还能使食品更多元。酸菜口感丰富，酸甜脆嫩，能够激发食欲、加快消化，促进人体对铁元素的吸收[2,3]。此外，酸菜不仅保留了蔬菜原有的营养成分如维生素C、氨基酸以及膳食纤维等营养物质，而且还含有乳酸菌等功能性微生物，酸菜作为营养成分丰富、滋味鲜美的蔬菜，长期食用可抗癌、治疗高血压和便秘、清理肠胃等[4,5]。但传统自然发酵的酸菜产品存在不稳定、发酵时间长、亚硝酸盐含量高等诸多问题，严重的制约着酸菜的工业化发展[6,7]。

红茶菌起源于我国秦朝时期，是由醋酸菌、酵母菌、乳酸菌在茶基液培养液中混合发酵而成，称为“海宝”、“胃宝”，现多称“红茶菌”，西方国家称其为“康普茶”[8]。因其发酵后母液中产生如茶多酚、小分子抑菌蛋白、D-葡萄糖二酸-1,4-内酯、氨基酸等诸多代谢产物，长期适量食用可起到降血压、抑菌、预防肥胖、调节肠道菌群等功效[9-12]。随着分子生物学技术与市场多元化的持续发展，目前市场上有关红茶菌的产品越来越多，如红茶菌醋、红茶菌面包、酒等。因此研究红茶菌，一方面不仅能增加红茶菌产品的风味和种类，另一方面也增加了茶叶的用途，促进茶产业与农业经济的发展。

基于诸多文献对红茶菌及其产品的研究，本实验在传统发酵酸菜的基础上采用红茶菌菌种发酵，以期在短时间内获得品质优安全性高且具有红茶菌风味的一款新型酸菜。

1 材料与方法

1.1 原料

1.1.1 实验材料

菌种：红茶菌菌种（俄罗斯纯正红茶菌菌种），购自黑龙江红茶菌网，后保藏于实验室；白菜、白砂糖（市售）、茶叶（正山小种）。

1.1.2 主要仪器设备

WFZ800-D3B紫外分光光度计，北京瑞利分析仪器公司；DH-101型电热鼓风干燥箱，天津市中环试验电炉有限公司；2019-B2322型手提式灭菌锅，上海东亚压力容器有限公司；HH-B11-360电热恒温培养箱，天津市实验仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 红茶菌酸菜发酵工艺流程

1.2.2 红茶菌酸菜发酵单因素试验

分别固定红茶菌接种量15%，发酵时间7 d，将发酵温度设定为15、20、25、30、35 ℃五个梯度、固定红茶菌接种量15%，发酵温度30 ℃，将发酵时间设置为为3、5、7、9、11 d五个梯度、固定发酵温度30 ℃，发酵时间7 d，将接种量别设定为5%、10%、15%、20%、25%五个梯度，发酵结束后以感官评价为主要指标，总酸含量和亚硝酸盐含量为辅助指标进行测定，以获得较优的发酵因素。

1.2.3 红茶菌酸菜发酵工艺响应面设计

以单因素试验中心点设置L9(34)试验，根据Design Expert 11中的BBD程序分析实验结果，详见表1。

表1 红茶菌酸菜工艺优化试验因素与水平设计Table 1 Factors and levels of response surface experiment for fermentation technology optimization of sauerkraut with Konbucha

1.2.4 感官评价定

结束发酵后，选10名专业人士从4个方面进行打分，评分标准见表2。

表2 红茶菌酸菜感官评价指标Table 2 Sensory evaluation standard for Kombucha sauerkraut

1.2.5 理化指标的测定

亚硝酸盐含量：参照GB 5009.33-2016《食品安全国家标准 食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》[13]。亚硝酸盐标准曲线见图1。

如图1所得到的亚硝酸盐标准曲线方程为y=0.0507x+0.0017，R2=0.9992，拟合度较高。

总酸含量：参照GB/T 12456-2008《食品中总酸的测定》[14]。

1.2.6 数据分析

单因素试验数据采用直观分析，以确定各因素对红茶菌酸菜发酵影响的参数区间。在单因素的基础上，应用Design Expert软件对数据结果进行统计分析。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验结果

2.1.1 发酵时间对酸菜品质的影响

对不同发酵时间的酸菜品质分析见图2、图3。

由图2可知，发酵时间为7 d时酸菜感官评分33。酸菜整体感官评分随着发酵时间延长而增加。但超过7 d后，酸菜的各项感官除香气外都呈现下降趋势，这是因为发酵时间过长，各菌体与白菜相互作用使得白菜逐渐开始变质，甚至发酵时间更久之后，酸菜会出现软烂的现象。

由图3可知，从发酵时间3 d到7 d，总酸含量从0.46 g/100 g升到1.79 g/100 g，上升趋势较为显著；但当发酵时间超过7 d后，从图中可看出总酸处于上升趋势，过多或过少的酸都会影响酸菜的口感与品质；亚硝酸盐含量第7天时为0.96 mg/kg，在第7天后下降缓慢并趋于平缓，由于发酵时间区间内亚硝酸含量均低于国标中所规定，这与李杰等[15]在利用面汤水发酵酸菜时的研究一致，故综合图2、3选择发酵时间7 d为响应面试验点。

2.1.2 不同发酵温度对酸菜品质的影响

对不同发酵温度的酸菜品质分析见图4、5。

由图4可知当发酵温度为30 ℃时，红茶菌酸菜感官评价为33分，发酵温度过高或者过低都会降低酸菜的感官品质。这是因为在发酵过程中若温度过低，其中菌种未达到最佳生长温度，从而影响酸菜的感官品质；当温度高于30 ℃时，除了红茶菌酸菜的香气略高，其余几项指标均呈现下降的趋势，这是因为较高的温度致使菌种在短时间内相互作用快速产生代谢产物加快酸菜的发酵，如若代谢产物过多则导致其滋味发生刺鼻味，色泽呈暗黄色，质地过软等情况。

由图5可知总酸含量从15 ℃的0.40 g/100 g上升到了30 ℃的1.85 g/100 g，但在30 ℃后有下降趋势但不明显；亚硝酸盐含量从15 ℃的1.67 mg/kg降到了35 ℃的0.79 mg/kg，但30 ℃后下降不显著，虽35 ℃时最低，但30 ℃时已远远低于国标规定，说明在较高的温度下，红茶菌中有益菌繁殖加快，抑制硝酸还原菌的生长繁殖，从而减少硼酸盐的还原，且已生成的亚硝酸盐在酸性环境下部分分解。这与丁健等[16]在响应面法优化水芹菜自然发酵酸菜结果分析一致。以图4为主要考察指标综合考虑选择发酵温度为30 ℃作为响应面优化试验点。

2.1.3 不同菌种量对酸菜品质的影响

对不同接种量的酸菜品质分析见图6、7。

从图6可知，接种量在5%～15%时感官评分逐渐升高，15%时到高达35分，但当接种量超过15%后，除香气外其余几项指标呈现逐渐下降，这是由于随着接种量的增加酸菜的香气也会越发浓郁，并可保留较长时间，但当菌种量增多时，其生长繁殖需要更多的营养成分，而发酵液中的营养成分有限，不能供给过多菌种的生长，从而影响菌种间的生长繁殖，而接种量过少时发酵速率缓慢，更易于受到有害菌的污染，影响产品的品质，使得感官评分总体降低。

由图7可知酸菜总酸含量从接种量5%的0.42 mg/kg升到15%的1.93 mg/kg，但在15%后持续上升使酸菜产生刺鼻的酸味从而影响口感和对人的第一感受，而此时亚硝酸含量为0.95 mg/kg，也符合规定，虽15%后逐渐缓慢降低，这与奉毅等[17]在红茶菌菌液对亚硝酸盐降解及NO的生成的影响一文中发现红茶菌可一定量的降解亚硝酸盐一致。综合两图选择以15%接种量为响应面优化试验点。

2.2 响应面试验结果分析

2.2.1 响应面试验结果

表3为试验结果，使用软件Design Expert 11.0得到的回归模型方程如下：

表3 Box-Behnken 试验设计及结果Table 3 Box-Behnken experimental design arrangement and results

2.2.2 模型方差分析

表4、5分别为总酸含量回归模型方差分析、感官评分回归模型方差分析。

表4 总酸含量回归模型方差分析Table 4 Analysis of variance for the fifi tted quadratic polynomial model with the total acid content

由表4和表5可知，两个模型具有极高的显著性（p<0.01），变量对于响应值的影响都表现为显著或失拟项结果为不显著（p>0.05），说明两种模型为差异极显著，设计模型有良好拟合性。两个模型的相关系数分别为 R2=0.9868，Radj2=0.9698，R2=0.9789，Radj2=0.9518，说明两个模型的回归拟合度较好，更接近实际试验，所以可使用该模型对于红茶菌酸菜的发酵工艺参数进行分析预测。

表5 感官评分回归模型方差分析Table 5 Analysis of variance for the fifi tted quadratic polynomial model with the sensory score

2.2.3 响应面图形分析（总酸）

图8～图10表明都有一定的交互作用，图8中沿A轴等高线相对密集一些，这说明对红茶菌酸菜总酸含量的影响红茶菌接种量比发酵温度大一些。图9可知对酸菜总酸含量的影响接种量比发酵时间更大。图10中沿A轴的等高线相对较密集，说明发酵温度影响比发酵时间大一些。综合三组图分析可知影响红茶菌酸菜总酸含量的因素强弱顺序依次为A>B>C。

2.2.4 响应面图形分析（感官评价）

图11表明接种量和发酵温度对其感官品质的影响交互作用不显著。图12表明接种量和发酵温度对红茶菌酸菜感官品质交互作用显著，A轴的等高线较C轴密集，表明菌种接种量对感官品质的影响大于发酵时间。图13中的等高线图可知发酵温度对感官品质的影响大于发酵时间。综合三组图分析可知影响红茶菌酸菜感官品质的因素强弱顺序依次为A>B>C。

2.3 确定最优条件及验证试验

根据模型可得出最优生产工艺为：接种量16.036%，发酵温度为29.791 ℃，发酵时间为7.143 d。便于实际生产，将工艺条件调整为：红茶菌接种量16%，发酵温度为30 ℃，发酵时间为7 d。以此工艺为条件进行三次平行实验得到的红茶菌酸菜感官评分为35分，总酸含量为1.87 g/100 g，产品中检出亚硝酸盐含量为0.84 mg/kg，远低于食品安全国家标准中对腌渍蔬菜中亚硝酸盐含量的限定。因此，利用响应面法优化得到的红茶菌酸菜生产工艺参数准确可靠，具有使用价值。

2.4 讨论

近年来利用红茶菌发酵的食品除了酸菜泡菜外，还有不同口味与功效的饮料、酸奶、面包、奶茶等[18-22]。本文研究的红茶菌酸菜是目前新开发的一种新型酸菜，可有效的利用红茶菌，并开拓了其多元化利用的新局面，增加市场占有率，还可增加酸菜的保健功能，丰富了酸菜市场[22]。本研究以低亚硝酸盐含量为出发点，通过响应面法优化并确定了红茶菌酸菜发酵的工艺参数。试验结果表明，采用合适的菌种添加量和发酵温度以及发酵时间，对发酵过程中产生亚硝酸盐有一定的抑制作用，并且可获得质量优、周期短、安全性能高的产品。这与陆春霞等[23]、崔松林[24]的研究结果相似。赵国忠等[25]对不同地区的24个酸菜样品进行感官分析与亚硝酸含量测定，发现感官得分较高的酸菜发酵过程中有益菌含量高，产酸量大，进而腐败菌生长较少，亚硝酸盐含量低。在响应面优化工艺条件下摸索出最优的工艺参数，为实际生产提供了可供参考的依据。

3 结论

本文通过单因素试验和响应面分析法确立了一种红茶菌酸菜的发酵工艺，结果表明：

（1）经响应面分析，红茶菌酸菜的最佳发酵工艺为：接种量16.036%，发酵温度为29.791 ℃，发酵时间为7.143 d。便于实际生产，将工艺条件调整为：红茶菌接种量16%，发酵温度为30 ℃，发酵时间为7 d。此工艺条件得到的红茶菌酸菜感官评分为35分，总酸含量为1.87 g/100 g，产品中检出亚硝酸盐含量为0.84 mg/kg，远低于食品安全国家标准中对腌渍蔬菜中亚硝酸盐含量的限定。

（2）通过对红茶菌酸菜加工工艺优化，结合红茶菌与白菜功效形成一款安全性高的特色风味酸菜，在提高白菜利用率与其农业附加值的同时也提升了红茶菌酸菜的品质，为酸菜市场多元化增添姿色。