四川雪茄烟叶在成熟与晾制和发酵过程中烟草特有亚硝胺的积累动态

孙雨琦，张蓝月，刘德水，秦艳青，赵园园，王 俊，张瑞娜，马雁军，李晶晶，周 骏，史宏志*

1. 河南农业大学烟草学院 烟草农业减害研究中心，郑州市文化路95 号 450002

2. 上海烟草集团北京卷烟厂有限公司，北京市通州区万盛南街99 号 100024

3. 中国烟草总公司四川省公司，成都市高新区世纪城路936 号 600041

4. 四川省烟草公司德阳市公司，四川省德阳市什邡回镇青雀路30 号 618400

烟草特有亚硝胺（Tobacco specific nitrosamines，TSNAs）是由烟草生物碱与含氮氧化物发生亚硝化反应生成的存在于烟叶和烟气中的一类有害成分，包括亚硝基降烟碱（NNN）、4-（N-甲基亚硝胺基）-1-（3-吡啶基）-1-丁酮（NNK）、亚硝基新烟草碱（NAT）和亚硝基假木贼碱（NAB）4 种［1］。研究表明，雪茄烟叶TSNAs含量相对较高，直接影响雪茄烟叶及其制品的安全性［2-4］。生物碱和亚硝酸盐是TSNAs形成的直接前体物，烟叶中TSNAs的形成和积累与两者含量关系密切［5］。TSNAs的形成和抑制技术一直是烟草研究的热点，杨焕文等［6］研究表明，TSNAs 主要在晾晒烟的变黄期形成；孙榅淑等［7］研究也认为，白肋烟等晾晒烟的调制阶段和调制后的贮藏阶段均是TSNAs 形成的重要时期；王娜［8］试验发现，烤烟TSNAs 的形成和积累主要发生在烟叶调制时期的变黄阶段。通过降低TSNAs合成的前体物生物碱和硝酸盐含量［9］、优化生物碱组成［10］、控制烟叶调制过程中温湿度、减少微生物活动［6］，以及适当降低烟叶贮藏温度、增加烟叶含水率、抑制气态氮氧化物的生成等均可有效降低TSNAs 的形成和积累［11-12］。雪茄烟叶的生产除调制外还需要经过特有的发酵过程。雪茄烟叶的发酵阶段是品质形成的延续，发酵过程中烟叶化学成分逐渐发生变化，烟叶外观品质及内在品质进一步提升［13］。Di 等［14］研究表明，雪茄烟叶的发酵阶段由于生物酶的催化作用，会将硝酸盐还原成亚硝酸盐，再与生物碱发生亚硝化反应，从而生成TSNAs。因此发酵阶段可能也是雪茄烟叶TSNAs 形成的重要时期［15］。但有关雪茄烟TSNAs形成的关键时期以及不同时期对TSNAs总量的贡献度目前尚不清楚。为此，测定了茄衣和茄芯两种雪茄烟叶成熟、调制和发酵过程中TSNAs、生物碱、硝酸盐含量的变化和积累量，旨在探讨TSNAs 在不同生产环节的形成规律，为生产上采取有效措施抑制TSNAs形成、降低雪茄烟叶有害物质含量提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验地点及材料

试验于2020年在四川省什邡市马祖镇进行。试验田前茬作物为水稻，土壤有机质3.01 g·kg-1，碱解氮120 mg·kg-1，速效钾89 mg·kg-1，速效磷38.1 mg·kg-1，pH 5.8～7.0。本试验中将德雪3 号作为茄衣品种，当地传统主栽品种什烟1号作为茄芯品种。

1.2 试验设计

德雪3号及什烟1号的试验田面积均为333.34 m2，烟苗于5月1日移栽，行距125 cm，株距40.5 cm。按照当地生产技术规范统一进行田间管理，烟田氮用量为180 kg·hm-2，m（N）∶m（P2O5）∶m（K2O）= 1∶0.5∶3。调制方式为晾制（晾制设施为钢结构现代化晾房，烟叶成熟时单片采收，晾制时间为25 d，在晾制过程中根据天气情况加温通风，晾制期间晾房平均温度为24.6 ℃，平均相对湿度为78.1%）。发酵方式为堆积发酵，发酵烟堆正中心放置温度计，监测温度。烟堆外用麻袋片进行覆盖，经过1周左右且温度达到55 ℃时进行翻堆。

烟叶在成熟采收前均选取大田长势和叶片成熟度相对一致的200株烟进行挂牌标记、定株，试验过程中对两个品种雪茄烟叶分不同时期、不同部位进行取样，均随机选取挂牌的20株烟叶。采收前期、晾制期和发酵期的取样部位均为中部叶及上部叶，每个部位各取5片烟叶。采收前取样时间为中部叶及上部叶未达到生理成熟前（生青）进行第1次取样，叶片由下向上逐渐成熟，待中部叶及上部叶达到适宜成熟度时分别进行第2次取样；晾制时期取样时间为变黄末期第1 次取样、变褐末期第2 次取样、干筋末期第3次取样。发酵时期取样时间为每次翻堆时取1次样，至发酵结束共取样4次。所取烟叶样品经过冷冻干燥后磨碎过筛（孔径0.25 mm），测定烟叶中TSNAs 及其前体物含量（质量分数），每样品重复测定3次。

1.3 测定方法

1.3.1 TSNAs含量测定

由上海烟草集团北京卷烟厂有限公司测定雪茄烟叶TSNAs含量。测定方法为固相萃取液相色谱质谱联用（SPE-LC-MS/MS）法［在线SPE 系 统：Symbiosis（Pico），荷兰Spark Holland 公司；质谱仪：AB SCIEX Triple Quad 5500，AB Sciex公司］。称取1.0 g 烟样，置于50 mL 锥形瓶中，加入40 µL 的4 种氘代TSNAs（内标）溶液（5 000 ng/mL）和30 mL 的100 mmol/L 乙酸铵水溶液，在室温下振荡萃取（200 r/min，60 min），萃取液过0.45 µm 水相滤膜后，用LC-MS/MS 检测萃取液中烟草特有亚硝胺含量（质量分数）［16］。NNN、NNK、NAT 和NAB 含量之和为TSNAs总量［8］。

1.3.2 生物碱含量测定

采用气相色谱法，将雪茄烟叶样品冻干后粉碎，过250 µm 筛。称取200 mg 烟末置于15 mL 旋盖培养试管中，加入内标溶液（7.5 µg/µL正十六烷内标溶液）100 µL，10%（质量分数）NaOH溶液1.5 mL，甲基叔丁基醚3 mL，旋紧旋盖，振荡5 min 后，室温放置22～26 h 后提取上层清液通过7890A 型气相色谱-氢火焰离子化检测器（美国Agilent公司）定量分析4种生物碱（烟碱、降烟碱、假木贼碱和新烟草碱）含量，计算其含量之和为总生物碱含量，并计算烟碱转化率。

烟碱转化率=［降烟碱含量/（烟碱含量+降烟碱含量）］×100%

1.3.3 硝态氮和亚硝态氮含量测定

采用浓H2SO4水杨酸法测定烟叶硝态氮（NO3--N）含量［17］。

1.3.4 数据处理

采用Excel 2010 与SPSS 22.0 软件进行方差分析和相关性分析，用LSD法进行差异显著性检验，采用Excel 2010和Origin 8.0软件绘制图表。

2 结果与分析

2.1 雪茄烟叶不同生产环节TSNAs含量的动态变化

2.1.1 德雪3号不同生产环节TSNAs含量的动态变化

德雪3 号中部叶和上部叶在不同生产环节TSNAs含量动态变化见图1。可以看出，德雪3号中部叶及上部叶在采收前、晾制期和发酵期TSNAs 含量的变化规律基本一致，即叶片中NNN、NAT、NAB、NNK 和TSNAs 总量在采收前积累量较少，而晾制期和发酵期积累量持续增加。其中，NNN采收前的积累比例为16.01%～16.52%，晾制期的积累比例为30.39%～38.81%，发酵期的积累比例为45.18%～53.10%；NAT 和NAB 采收前的积累比例为5.24%～11.09%，晾制期的积累比例为26.12%～56.21%，发酵期的积累比例为38.17%～68.65%；NNK 成熟采收前的积累比例为15.98%～22.40%，晾制期的积累比例为45.42%～48.32%，发酵期的积累比例为30.65%～35.70%；TSNAs 总量采收前积累比例为10.98%～11.12%，晾制期的积累比例为30.65%～42.73%，在发酵期的积累比例为46.29%～58.23%。

2.1.2 什烟1号不同生产环节TSNAs含量的动态变化什烟1 号中部叶和上部叶在不同生产环节TSNAs含量动态变化见图2。可以看出，什烟1号中部叶及上部叶中NNN、NAT、NAB、NNK 含量和TSNAs 总量在采收前、晾制期和发酵期呈持续增加趋势，且采收前积累量较少，晾制期和发酵期积累量较多，与德雪3 号在不同时期TSNAs 的积累规律一致。NNN成熟采收前的积累比例为3.03%～11.47%，晾制期的积累比例为45.52%～49.58%，发酵期的积累比例为38.94%～51.44%；NAT 和NAB 成熟采收前的积累比例为15.38%～20.39%，晾制期的积累比例为35.95%～58.40%，发酵期的积累比例为26.22%～44.23%；NNK采收前的积累比例为13.48%～14.45%，晾制期的积累比例为39.17%～48.13%，发酵期的积累比例为38.39%～46.38%；TSNAs 总量采收前的积累比例为5.91%～14.02%，晾制期的积累比例为45.26%～48.22%，在发酵期的积累比例为40.71%～45.87%。

图2 什烟1号不同生产环节TSNAs含量的动态变化Fig.2 Dynamic variations of TSNA contents in Shiyan 1 at different production stages

2.2 雪茄烟叶不同生产环节生物碱含量的动态变化

德雪3 号及什烟1 号中部叶和上部叶在不同生产环节生物碱含量动态变化见图3 和图4。可以看出，两种雪茄烟叶中均以烟碱含量最高，假木贼碱含量最低。德雪3 号在采收时的烟碱含量为2.87%～3.71%，在晾制末期含量为2.35%～3.27%，在发酵末期含量为1.80%～2.60%；什烟1号在采收时的烟碱含量为5.01%～5.34%，在晾制末期含量为2.50%～2.80%，在发酵期末期含量为1.48%～1.99%。两个品种雪茄烟叶中烟碱及总生物碱含量均在采收前大量积累，在晾制和发酵环节呈持续下降趋势。

图3 德雪3号不同生产环节生物碱含量的动态变化Fig.3 Dynamic variations of alkaloid contents in Dexue 3 at different production stages

图4 什烟1号不同生产环节生物碱含量的动态变化Fig.4 Dynamic variations of alkaloid contents in Shiyan 1 at different production stages

2.3 雪茄烟不同时期TSNAs、生物碱和NO-N 含量比较

在成熟末期、晾制末期、发酵末期对德雪3 号及什烟1号烟叶TSNAs、生物碱和NO-N 含量进行差异显著性分析，结果见表1。可以看出，两种雪茄烟叶TSNAs 总量在成熟、晾制和发酵过程中均呈现升高趋势，且晾制末期TSNAs总量显著高于成熟末期，发酵末期TSNAs总量显著高于晾制末期；烟碱、生物碱总量在成熟、晾制和发酵过程中呈下降趋势，且成熟末期含量显著高于晾制末期，晾制末含量显著高于发酵末期；NO-N 含量在成熟、晾制和发酵过程中呈下降趋势，且成熟末期含量最高，显著高于发酵末期，这可能是由于在晾制和发酵过程中微生物活性增强，将硝酸还原成了亚硝酸。

表1 雪茄烟叶不同时期TSNAs、生物碱和NO-N含量比较①Tab.1 Contents of TSNAs, alkaloids and NO-N in cigar tobacco at different stages

表1 雪茄烟叶不同时期TSNAs、生物碱和NO-N含量比较①Tab.1 Contents of TSNAs, alkaloids and NO-N in cigar tobacco at different stages

（部位） 时期 TSNAs/（ng·g-1）NNN NAT NAB NNK 总量品种生物碱/%烟碱 降烟碱 假木贼碱 新烟草碱 总量NO3--N/（μg·g-1）德雪3号（中部叶）德雪3号（上部叶）成熟末期晾制末期发酵末期成熟末期晾制末期发酵末期124.25c 352.82b 752.26a 70.30c 240.76b 439.21a 45.85c 274.54b 875.62a 46.66c 390.95b 781.60a 2.34b 10.90b 21.11a 1.08b 11.85b 19.16a 35.82b 144.10a 224.10a 35.49b 107.46a 158.46a 208.26c 782.36b 1 873.09a 153.53c 751.03b 1 398.42a 2.87a 2.35b 1.80c 3.71a 3.17b 2.59c 0.14a 0.10a 0.09b 0.13a 0.13a 0.13a 0.02a 0.02a 0.02a 0.02a 0.02a 0.02a 0.27a 0.17a 0.22a 0.25a 0.23a 0.18b 3.29a 2.64b 2.13c 4.11a 3.66b 2.93c 5 128.36a 3 349.25b 1 973.13c 2 588.06a 1 862.29b 1 128.36c

表1（续）

3 讨论

晾制及发酵环节是雪茄烟叶外观质量及内在品质形成的重要时期［12］。本研究中发现，这两个生产环节也是TSNAs形成积累的关键时期。晾制前的雪茄烟叶中TSNAs 积累量较小，这主要是由于细胞的完整性使TSNAs 的合成前体物相互隔离，不能聚合在一起发生反应。雪茄烟叶在晾制过程中TSNAs的形成可能与微生物的活动密切相关。对白肋烟晾制过程中TSNAs 形成规律和机理的研究表明，烟叶变黄末期是TSNAs形成的主要时期，在晾制过程中，烟叶组织水分散失，细胞膜逐渐破坏，膜的通透性加大，细胞内含物外渗，导致微生物大量繁殖，使硝酸还原为亚硝酸，进而与生物碱发生亚硝化反应生成TSNAs［18-19］。在雪茄烟叶调制过程中TSNAs的形成也主要发生在烟叶的变黄期和褐变期，关于调制过程中烟叶表面微生物的变化及与调制环境的关系尚需进一步试验。雪茄烟叶的发酵是在高温和高湿条件下完成的，这种条件不仅可能造成微生物活动增强，使硝酸还原为亚硝酸，也可能会导致高温条件下烟叶硝酸盐直接产生气态氮氧化物。对贮藏过程中烟叶TSNAs 形成机理的研究表明，高温条件下可通过化学作用使硝酸盐直接产生气态氮氧化物，进而促使生物碱发生亚硝化反应形成TSNAs［9，20］。雪茄烟叶发酵温度、湿度和发酵周期均会影响雪茄烟叶TSNAs 形成［12，21］，因此雪茄烟叶发酵过程中TSNAs的形成机理较复杂，阐明其作用机理，明确微生物和温湿度条件对TSNAs 积累的贡献，有效降低发酵过程中TSNAs 的形成和积累以及采取有效措施抑制TSNAs形成等方面仍有待进一步深入研究。

4 结论

雪茄茄衣和茄芯烟叶在成熟、调制和发酵过程中各TSNAs组分和TSNAs总量积累差异较小，均表现为成熟采收前TSNAs 的积累比例较小，晾制和发酵期时期TSNAs积累比例较大。在晾制和发酵环节茄衣品种德雪3 号TSNAs 总量的积累比例分别为30.65%～42.73%和46.29%～58.23%，茄芯品种什烟1号TSNAs总量的积累比例分别为45.26%～48.22%和40.71%～45.87%。因此，晾制及发酵环节是雪茄茄衣和茄芯烟叶TSNAs形成的关键时期。