烟草硝酸盐转运蛋白NtNRT1.7 基因的克隆、亚细胞定位及表达模式分析

尹卓然，王 驰，轩栋栋，罗 勇，连文力，贾宏昉*

1. 河南农业大学烟草学院，郑州市文化路95 号 450002

2. 厦门大学生命科学学院，福建省厦门市翔安区翔安南路4221-120 号 361000

烟草是我国重要的经济作物，在生产过程中常施用硝态氮肥以提升烟叶的产量和品质。硝态氮（NO3-）不仅是一种营养物质还可以作为信号分子调节叶片生长［1］。Tahir 等［2］研究表明植物吸收与利用硝态氮（NO3-）主要是通过硝酸盐转运蛋白（Nitrate transporter，NRT）完成的。当外部硝酸盐浓度小于1 mmol/L 时，主要是NRT2 家族编码的高亲和硝酸盐转运蛋白系统（High-affinity nitrate transporter system，HATS）负责吸收和转运硝酸盐；当外部硝酸盐 浓 度 大 于1 mmol/L 时，NRT1/PTR（Nitrate transporter 1/Peptide transporters，NPF）家族编码的低亲和硝酸盐转运蛋白系统（Low-affinity nitrate transporter system，LATS）负责对外部硝酸盐进行吸收与转运［3-6］。由于适合烟草幼苗根系生长和叶片生物量积累的氮浓度为4 ～6 mmol/L［7］，故在适宜植物根系与叶片生长条件下硝酸盐的吸收、转运和再利用主要由NRT1/PTR家族负责，该家族在植物正常的生长发育过程中发挥关键作用［8-9］。

目前植物中关于NRT1 基因家族成员的研究主要集中在拟南芥和水稻中。已发现拟南芥中有53个NRT1/PTR家族成员基因［10］，12个基因的功能已经明确［11］，其中：AtNRT1.4 参与叶柄中硝酸盐的积累［12］；AtNRT1.5 主要参与硝酸根向木质部的装载［13］；AtNRT1.6 主要影响拟南芥胚的早期发育［14］；AtNRT1.7主要参与介导拟南芥韧皮部硝酸盐再利用的过程［15-16］。水稻中至少有80 个NRT1/PRT 家族成员［17-18］，7个基因的功能已经明确［11］，其中：OsNPF7.2［19］是水稻中第一个鉴定出的参与液泡NO3-运输的NPF基因，对根细胞内硝酸根的平衡有重要意义；OsNPF2.2［20］参与了根中NO3-向地上部分的运输。而烟草NRT1/PTR 家族成员至少有9 个成员，目前仅Liu 等［21］初步研究了烟草NRT1 家族的2 个基因，其中NtNRT1.1在根系中特异性表达，而NtNRT1.2主要在衰老叶片中强烈表达，其余烟草NRT1家族基因的功能研究还鲜见报道。因此，克隆烟草硝酸盐蛋白家族成员NtNRT1.7，鉴定其同源关系，测定不同氮浓度处理和不同非生物胁迫下基因的表达模式，旨在探究NRT1.7基因在胁迫条件下对氮素的调控机制，为培养氮素高效利用新品种提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

普通烟草品种K326在培养箱中培养，培养箱周期设置为16 h/8 h（光/暗），光强设置为300 μmol·m-2·s-1，温度设置为28 ℃/22 ℃（光/暗），相对湿度设置为60%。对其进行不同氮素条件、盐处理、干旱处理和低温处理。正常处理所采用的营养液试剂及其浓度为：5 mmol/L NaNO3；1 mmol/L NaH2PO4·2H2O；1 mmol/L K2SO4；0.75 mmol/L CaCl2·2H2O；0.5 mmol/L MgSO4·7H2O；9 µmol/L MnCl2·4H2O；0.03 µmol/L（NH4）2MoO4；46 µmol/L H3BO3；8 µmol/L ZnSO4·7H2O；3 µmol/L CuSO4·5H2O；20 µmol/L FeSO4·7H2O和Na2-EDTA螯合物，pH调至7.0。采用霍格兰营养液水培法，在种子露白后使用1/4正常营养液培养3 d，之后更换为1/2 正常营养液培养3 d，最后更换为正常营养液培养4 d，培养结束后开始处理。氮素处理：设置正常处理（CK：5 mmol/L NO3-）和低氮处理（LN：0.25 mmol/L NO3-）2 个处理，处理时间分别为7 d；盐胁迫处理：150 mmol/L NaCl 处理7 d；干旱处理：10%的PEG-6000处理7 d；低温处理：4 ℃处理3 h。结束后取各处理长势一致的3株幼苗用去离子水洗涤，提取样品的根、茎、幼叶和老叶（幼叶为完全展开的叶片从上往下数第2片，老叶为完全展开的叶片从上往下数第7片），获得检测基因表达模式分析的供试材料。

1.2 目的基因的克隆

参考烟草、拟南芥和水稻等物种在GenBank 收录的NRT1 基因序列，应用Sol Genomics Network 和NCBI网站Blast程序搜索烟草EST序列数据库。使用Primer Premier 6软件设计烟草引物（表1），以烟草cDNA 为模板进行PCR 扩增，扩增条件为：94 ℃5 min；94 ℃30 s，58 ℃30 s，72 ℃2 min，35 个循环；72 ℃5 min。将扩增目的片段连接在中间载体pMD19-T 上，后送Invitrogen 生物公司测序验证，获得全长cDNA序列信息。

表1 RT-PCR和定量PCR扩增引物序列Tab.1 RT-PCR and quantitative PCR amplification primer sequences

1.3 序列分析方法

利 用NCBI 软 件 的ORF finder（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）进行基因序列的蛋白翻译。利用Expasy（https：//web.expasy.org/protparam/）和PRABI（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_auto mat.pl?page=/NPSA/npsa_sopm.html）分析NtNRT1.7的蛋白结构，利用NetPhos 3.1（https：//services.health tech.dtu.dk/service.php?NetPhos-3.1）预测NRT1.7 的磷酸化位点。利用TMHMM 2.0（https：//services.hea lthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0）预测NRT1.7蛋白的跨膜结构域。利用DNAMAN 进行蛋白质多序列比对分析；利用MEGA 6.0 制作邻接树（Neighbor-Joining Tree），分析NtNRT1.7 与NRT1 家族成员的亲缘关系；在线网站MEME（https：//meme-suite.org/meme/tools/meme）分析序列基序（Motif），利用TBtools［22］将系统进化树和Motif组合，对NRT1.7 与烟草、拟南芥和水稻中的NRT1 家族进行对比分析。

1.4 启动子分析

以烟草NtNRT1.7 基因全长序列为探针，利用Sol Genomics Network 网站进行Blast 搜索基因全长，在起始密码子ATG 上游取一段长1 500 bp 的启动子序列，利用PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）在线工具分析启动子序列的顺式元件。

1.5 亚细胞定位分析

设计带有酶切位点的特异引物，将扩增得到的PCR 产物连到经内切酶酶切的pBWA（V）HS-GLosgfp 载体上，连接产物转化到大肠杆菌DH5a 中，对阳性克隆进行测序验证，获得融合载体pBWA（V）HS-NtNRT1.7-GLosgfp。采用注射烟草表皮细胞的方法，将表达载体导入烟草表皮细胞，并置于22 ℃培养箱中培养30～60 h 后，利用激光共聚焦显微镜观察荧光蛋白在烟草表皮细胞中的位置，未插入NtNRT1.7基因的pBWA（V）HS-GLosgfp空载体作对照。

1.6 基因表达分析

按 照Invitrogen 公 司 的RealMasterMix（SYBR Green）试剂盒说明书进行实时定量RT-PCR检测，实时定量的实验数据以烟草组成型表达基因NtL25（GenBank：L18908.1）为内参基因，进行3 次重复试验，采用2-ΔΔCT）算法进行分析。假设目的基因在胁迫处理下的表达量是对照（正常培养）的N 倍，N =2-ΔΔCT，ΔΔCT=Treat（CT样品-CTL25）-CK（CT样品-CTL25）［23］。

1.7 数据分析

使用DPS 7.5 软件进行单因素完全随机试验统计分析，运用LSD 法进行多重比较，分析1%水平下的显著性，运用Origin 2018 制作基因相对表达量柱形图。

2 结果与分析

2.1 基因的克隆与序列分析

以K326 的cDNA 作为模板，进行PCR 扩增，琼脂凝胶电泳结果（图1）显示克隆基因全长在1 500 bp和2 000 bp之间。进一步对克隆基因NtNRT1.7的全长进行序列分析，该序列全长为1 839 bp，可编码612个氨基酸。

图1 NtNRT1.7全长基因PCR扩增电泳图谱Fig.1 Electrophoretogram of PCR amplification of full-length NtNRT1.7

2.2 生物学分析

2.2.1 NtNRT1.7蛋白结构

分析NtNRT1.7 蛋白结构可知，其分子式为C3133H4877N793O859S30，分子量为68 358.78，理论等电点（pI）为8.91，含有45 个酸性氨基酸和53 个碱性氨基酸，不稳定性指数（Ⅱ）为40.08，属于不稳定蛋白。该蛋白的二级结构主要包含了46.08%的α螺旋，12.42%的β折叠结构和37.91%的不规则卷曲结构。

由磷酸化位点分析结果可知，NtNRT1.7 中含有37个丝氨酸、16个苏氨酸和7个酪氨酸，推测在这些位点可能发生磷酸化。

2.2.2 NtNRT1.7的跨膜结构域分析

图2（0～1 之间）表示氨基酸位于螺旋、内部或外部的总概率，顶部（1～1.2 之间）表示NtNRT1.7 跨膜结构的最佳预测，也是总体最可能的结构。预测结果显示NtNRT1.7含有12个疏水的跨膜螺旋区，其中在第6 个和第7 个跨膜区之间有一个中央亲水环将其分隔为2组。

图2 NtNRT1.7蛋白跨膜结构域分析Fig.2 Transmembrane domain analysis of NtNRT1.7 protein

2.2.3 NtNRT1.7同源性与系统发育树分析

NtNRT1.7 与拟南芥、水稻中NRT1 家族成员的同源性分析结果如图3 所示。 NtNRT1.7 与NtNRT1.1 和NtNRT1.2 同源性分别为30.95%和31.43%；与AtNRT1.7 的同源性达到57.23%；与水稻OsNRT1.7 的同源性达35.51%。NtNRT1.7 与拟南芥AtNRT1.7、AtNRT1.6 的亲缘关系较近（图4），同时NtNRT1.7与拟南芥AtNRT1.7含有相似的Motif。

图3 氨基酸序列同源性分析Fig.3 Homology analysis of amino acid sequences

图4 NtNRT1.7系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree of NtNRT1.7

2.3 启动子分析

如图5 所示，NtNRT1.7 除含有启动子所必需的TATA-box和CAAT-box外，还含有3个脱落酸反应性涉及的顺式元件（ABRE），1 个生长素反应元件（TGA-element）和3 个MBS。其中，ABRE 与转录因子结合，促进或抑制脱落酸诱导基因的表达，从而表现出加速或减缓植株衰老过程；TGA-element与生长素响应因子结合后可以促进或抑制基因的转录，从而影响植株的生长；MYB 与CAACTG 基序（MBS）结合激活了基因的表达，参与苯丙烷类代谢途径，进而增强抗植株抗逆性。

图5 NtNRT1.7启动子克隆及启动子顺式元件分析Fig.5 NtNRT1.7 promoter cloning and analysis of its cis-elements

2.4 亚细胞定位

激光共聚焦显微镜下观察到在细胞膜上存在GFP 信号（图6），说明转pBWA（V）HS-NtNRT1.7-GLosgfp 融合蛋白存在于细胞膜上，NtNRT1.7 为膜蛋白，可作为载体转运物质进出细胞。

图6 NtNRAT1.7亚细胞定位Fig.6 Subcellular localization of NtNRT1.7

2.5 表达特性

2.5.1 氮素处理下不同部位NtNRT1.7 基因的表达特性

图7 可见，在正常处理下（CK：5 mmol/L NO3-），NtNRT1.7 主要在叶片中高表达，老叶相对表达量是根部相对表达量的105倍，叶片与根部的相对表达量间存在极显著差异。在低氮处理下（LN：0.25 mmol/L NO），NtNRT1.7 在幼叶和根中的相对表达量有所增加，老叶中的相对表达量是正常处理下的20%，NtNRT1.7的相对表达量总体不及正常处理。整体来看，NtNRT1.7主要在叶片，尤其是衰老的叶片中高表达，低硝态氮处理时会抑制表达。

2.5.2 不同非生物胁迫下NtNRT1.7基因的表达特性图8 可见，在不同生物胁迫下NtNRT1.7 基因的相对表达量均显著增加。与正常处理相比，盐胁迫、干旱胁迫与低温胁迫条件下NtNRT1.7 相对表达量分别增加1.16 倍、1.29 倍和2.76 倍，存在极显著差异。以上结果表明，NtNRT1.7 在烟草非生物胁迫应答方面发挥着重要的作用。

图8 不同非生物胁迫下NtNRT1.7基因的相对表达量Fig.8 Relative expression of NtNRT1.7 gene under different abiotic stresses

3 讨论

在烟草K326 中克隆出了NtNRT1.7 基因，对NtNRT1.7 进行了生物学分析。结果显示NtNRT1.7包含12个跨膜结构，且在第6和第7个跨膜结构间有1个中央亲水环，这与Tsay等［24］高等植物NRT1/PTR（NPF）在第6和第7个跨膜结构间有1个中央亲水环的研究结果一致。NtNRT1.7与AtNRT1.7高度同源，亲缘关系较近，此外还发现NtNRT1.7蛋白定位在细胞质膜上，Fan 等［16］的研究中也证实AtNRT1.7 蛋白定位于细胞质膜上，参与硝酸盐的再利用，初步猜测NtNRT1.7是具有吸收和转运硝酸盐功能的膜蛋白。

进一步分析烟草NtNRT1.7 的表达特征发现该基因主要在衰老的叶片中表达，其表达量为幼叶的8倍，根部的105 倍；在低氮条件下，NtNRT1.7 在幼叶中表达增强，在老叶和茎中表达减弱，这是因为烟株吸收硝酸盐后优先供给幼叶生长，之后转运至中下部叶，最后到达根部［25］。在老叶中高表达暗示了NtNRT1.7 可能参与硝酸盐的转运和再利用；老叶和茎中表达量降低暗示了低氮条件抑制了NtNRT1.7对硝酸盐的转运。下一步可通过转基因技术获得NtNRT1.7过量表达的转基因株系，研究NtNRT1.7在提高烟草氮素利用效率方面的功能。

NtNRT1.7 的启动子中除含有TATA-box 和CAAT-box等组织特异性元件外，还含有参与防御和应激反应的特异转录因子［26-27］结合的顺式元件。其中MYB 通过调控相关基因的表达来促进特定代谢产物花青素［28］的生成与积累，进而增强抗干旱能力，暗示该基因可能参与各种非生物胁迫的调控。因此，通过qRT-PCR 进一步研究NtNRT1.7 在不同非生物胁迫处理条件下的表达情况，发现NtNRT1.7 基因受干旱、高盐和冷害的胁迫诱导并增强表达，这和启动子序列分析的结果（含有3 个ABRE 基序，3 个MBS基序）一致，表明该基因可能参与了多种非生物胁迫下氮素的吸收与再利用。

4 结论

在烟草中克隆了低亲和硝酸盐转运蛋白基因NtNRT1.7，研究了NtNRT1.7 的蛋白结构、跨膜结构域、同源性和亚细胞定位，发现该蛋白是膜蛋白，可能参与硝酸盐的转运。启动子顺式元件分析与基因的表达模式分析结果显示，正常处理下NtNRT1.7 在老叶中高表达，低氮处理后NtNRT1.7 在老叶的表达量降低，非生物胁迫下表达量增强，说明该基因在受低硝态氮处理时抑制表达，可能参与调控烟叶非生物胁迫下硝酸盐的转运和再利用。