高压脉冲电场咖啡液灭菌实验及跨膜电压仿真研究

李 峰，刘 昊，董 会，魏建华

(1.上海电力大学电气工程学院，上海 200090； 2.中国工程物理研究院，四川 绵阳 621000)

1 引言

高压脉冲电场(High voltage Pulsed Electric Field，HPEF)灭菌技术，具有处理时间短、能耗低、灭菌效率高、温升小、不会破坏液体食品的风味和营养成分等优势，广泛用于液体食品的加工。该技术通过施加高压脉冲电场，在微生物细胞膜上形成跨膜电压，致使细胞膜结构受损，最终达到灭菌的目的。

早在1967年，英国学者就发现25 kV/cm的直流脉冲能有效致死营养菌和酵母菌[1]。在PEF灭菌技术中，通过研究电场强度和脉冲作用时间等可以探索微生物灭活规律。文献[2]研究了高压脉冲电场对胡萝卜汁等液体食品的非热灭菌效果，灭菌效果相当可观，并分析了影响灭菌效果的因素以及灭菌机理。张婕等人基于高压脉冲电场灭菌技术对生牛乳进行处理，分析了影响处理效果的因素，研究证实增大脉冲宽度能够降低牛奶中单细胞微生物的数目，处理完成后牛奶温度上升幅度较小[3]。尽管对于高压脉冲电场灭菌技术的研究较多，但是目前仍然处于初级阶段，现有的技术还不够成熟，其在工业上的应用主要集中于果汁、牛奶等液体食品中。咖啡作为世界上最流行的饮料之一，越来越受到人们的喜爱，然而针对咖啡液的高压脉冲电场灭菌技术研究非常少，需要深入研究相应的灭菌规律和灭菌工艺，为该技术在咖啡灭菌应用奠定理论基础和技术支撑。

良好的高压脉冲电场处理系统是杀菌技术得以应用的前提，设计的关键是高压脉冲发生器和处理腔。本文设计并搭建了一套高压脉冲电场灭菌装置，对其输出电压波形进行了仿真。在此基础上，研究了其对咖啡液酵母菌的灭菌效果，探索了脉冲电压、充电电容、脉冲时间对灭菌效果的影响规律，推导了单个酵母菌细胞在脉冲电场中的跨膜电压计算公式，并利用有限元法建立了单个酵母菌细胞跨膜电压仿真模型，得到酵母菌在高压脉冲电场下的跨膜电压分布规律，为工艺改进及实际生产提供了指导。

2 实验方法及实验设备

2.1 实验方法

本实验设计并制作了一套高压脉冲电场灭菌装置，可产生波形为指数衰减波的脉冲电场，将脉冲电场施加在植入了酵母菌的咖啡液上，探究高压脉冲电场灭菌技术在咖啡液中的可行性。影响高压脉冲电场灭菌率的主要参数为脉冲电压、脉冲宽度、脉冲作用时间，以此为基础进行实验探究。

本实验使用的高压脉冲电场灭菌装置主要由高压脉冲电源回路、处理腔、蠕动泵、物料罐、检测装置组成[4,5]。

通过蠕动泵将咖啡液物料管中的试品送入循环系统中，试品通过处理腔时，在高压脉冲电源的作用下灭菌，再流回物料管，灭菌进行到一定时间时，在循环系统的取料口进行取样检测，实验接线简图如图1所示。

图1 实验接线简图Fig.1 Schematic diagram of experimental wiring

2.2 灭菌效果检测方法

在检测灭菌效果时，依据GB/T 4789.15—2016标准实现酵母菌群的计数过程，采用平板计数法，使用37XB-PC光学生物显微镜进行计数。灭菌效果用酵母菌细胞残活率S来表示，公式如下[6]：

(1)

式中，N为脉冲电场处理后样品中的菌落数；N0为脉冲电场处理前样品中的菌落数。

2.3 高压脉冲发生器

高压脉冲发生器是高压脉冲装置的核心，为灭菌系统提供电源。从结构上看，可以划分为多个部分，包括升压变压器、整流模块、调压器和触发开关[7]。根据脉冲波形的不同可分为方波、指数衰减波、振荡衰减波等。综合考虑到性能以及成本的要求，本电路结构如图2所示，输出波形为指数衰减波。

图2 高压脉冲电源工作原理电路图Fig.2 Working principle circuit diagram of high voltage pulse power supply

图2中，AC为工频交流电源，T为升压变压器,D1～D4为四个2 CL/40 kV/5 A型号的高压二极管，R为阻值10 kΩ的充电电路保护电阻，C1为充电电容兼做滤波电容，S1为旋转火花开关，虚线框内为处理腔，可以等效为并联的电容CX和电阻RX。

工频电源经过升压变压器T升压之后，再通过四个高压二极管D1～D4组成的高压整流硅堆整流，向高压电容器C1充电，电容器上储存的电能在旋转火花开关S1闭合的瞬间，向处理腔中的咖啡液放电，从而形成高压脉冲电场，脉冲电压的幅值等于充电电压最大值[8]。

将实验元器件参数输入到Matlab仿真模型中，得到的高压脉冲电源输出电压波形如图3所示，使用示波器实测得到的高压脉冲电源输出电压波形如图4所示。仿真结果显示波形为指数衰减波，实测波形与仿真波形相一致，满足设计要求。

图3 高压脉冲输出仿真波形图Fig.3 Simulation waveform of high voltage pulse output

图4 高压脉冲输出实测波形图Fig.4 Measured waveform of high voltage pulse output

2.4 处理腔

处理腔可以将电源形成的高压脉冲电场施加到流经其中的咖啡液上，以达到灭杀咖啡液中酵母菌的效果。

处理腔在结构上可分为平板电极处理腔、针板电极处理腔和同轴圆柱电极处理腔。根据处理液体是否循环流动，可分为静置处理腔和动态处理腔[9]。平板电极处理腔制造简单，但比较难获得较高场强，对高压脉冲电源的要求较高；而针板处理腔有效处理区域较小，处理效率低。综合考虑成本及处理效率问题，本实验设计并制造了动态同轴圆柱电极处理腔[10,11]，其结构如图5所示。

图5 同轴圆柱处理腔Fig.5 Coaxial cylindrical processing cavity

同轴圆柱电极处理腔的电场属于稍不均匀电场，在实验电压下不会出现火花放电，能够有效防止电极电解对于咖啡液的污染，保证较高的食品质量。

由于咖啡液电导率较高，处理腔的电极应采用高强度、高电导性材料；绝缘部分应采用绝缘强度高、耐高温且支撑性强的材料。所以电极材料采用不锈钢，绝缘密封材料为聚四氟乙烯。处理腔内电极半径为8 mm，外电极内半径为12 mm，有效处理长度为100 mm。进料口和出料口位于外电极上相反的两侧，内半径3 mm，外半径4 mm，使整个处理腔可以通过硅胶软管接入到循环系统中。

2.5 实验参数

本次研究中利用了不同的脉冲电压幅值和充电电容对咖啡液进行灭菌处理，相关的参数见表1。

表1 高压脉冲实验参数Tab.1 High voltage pulse experimental parameters

3 实验结果及分析

3.1 脉冲电压幅值对处理效果的影响

对接种酵母菌的咖啡液，保持充电电容和实验时间不变，施加不同幅值波形为指数衰减波的脉冲电压。观察实验前后咖啡液中的酵母菌菌群，经过高压脉冲电场灭菌后的残活率如图6所示。

图6 电压对酵母菌残活率的影响Fig.6 Effects of voltages on yeast viability

由图6可知，随着脉冲电压的增大，咖啡液中的酵母菌细胞残活率降低。

脉冲电压幅值主要影响处理腔电场强度，处理腔电场强度与脉冲电压幅值之间的关系为：

(2)

式中，E为处理腔电场强度；U为脉冲电压幅值；a、b分别为内电极半径和外电极内半径；r为所求位置与轴心的距离[12]。

通过计算可得到不同脉冲电压下的处理腔电场强度(见表2)，结果表明，对于固定处理腔，施加的脉冲电压越大，对应的电场强度也就越大。根据文献[12]，酵母菌残活率随着电场强度增大而降低。所以理论上脉冲电压越大，灭菌效果会越好。

表2 电场强度与脉冲电压幅值的关系Tab.2 Relationship between electric field strength and pulse voltage

3.2 充电电容对灭菌效果的影响

保持脉冲电压幅值与实验时间不变，使用不同的充电电容进行实验。经过高压脉冲电场灭菌后酵母菌的残活率如图7所示。

图7 充电电容对酵母菌残活率的影响Fig.7 Effect of charging capacitance on residual viability of yeast

结果表明：在相同的脉冲电压下，充电电容越高，酵母菌残活率越低。

充电电容主要影响单次充电所储存的能量，该能量可以通过式(3)计算得到：

(3)

式中，C1为储能电容的容量；Um为充电电压的最大值；EC为电容充电储存总能量。充电完成后，电容储存的能量通过旋转开关后施加到处理腔上，处理腔的释放能量与放电电压的时间关系为：

(4)

式中，EO为单次释放的能量；t为放电时间；ZX为处理腔阻抗。释放能量时，储能电容的放电效率为[13]：

(5)

实验中，由于电容需要多次充放电，所以不考虑放电电压约束的影响，放电效率近似等于100%，可以认为总能量在一次放电过程中全部释放。充电电压不变的情况下，电容C1容量越大，储存的能量EC越多，单次释放的能量EO也就越多。处理腔阻抗恒定，所以释放的能量越多，能量在处理腔上的释放时间t越长，对酵母菌产生的累积效应越明显，灭菌效果越好。

3.3 实验时间对处理效果的影响

使用10 kV的脉冲电压，1 μF的充电电容，对试品处理40 min，从10 min开始，每隔5 min进行取样检测，实验结果如图8所示。

实验结果表明：施加高压脉冲电场的时间越长，酵母菌残活率越低，并且随着时间的延长，残活率降低的速度越来越慢。

在脉冲频率一定的情况下，实验时间越长，施加的脉冲数目越多，高压脉冲电场对酵母菌细胞膜跨膜电压的累积效应越明显。即脉冲数目累积得越多，灭菌效果越好。随着实验时间的延长，咖啡液中存活的酵母菌浓度会降低，根据文献[14]，酵母菌浓度越低越难灭活，所以残活率降低的速度会越来越慢。

分析实验结果可得，增大充电电容、延长实验时间是通过时间的累积效应促进灭菌，并且都存在一定的边际效应。所以脉冲电压对酵母菌残活率的影响最明显且最值得研究。

4 高压脉冲电场下的酵母菌跨膜电压

根据第3节分析，脉冲电压是酵母菌失活最主要的影响因素，符合电崩解理论对高压脉冲电场灭菌技术的机理解释[15]。

4.1 电崩解理论

图9为电崩解过程示意图，电崩解理论认为，在高压脉冲电场的作用下，酵母菌细胞膜内外两侧产生了电势差，即跨膜电压。在跨膜电压的作用下，细胞膜的厚度减小，并且外部电场的电压越大，其厚度减小越明显。如果跨膜电压增大到某个阈值，细胞膜会被击穿，由此导致崩解孔的形成。但是该过程具有一定的可逆性，即在崩解孔面积较小时，外加电场消失，崩解孔能够愈合。崩解孔面积在细胞膜表面积中占比过大，或者崩解孔的面积较小，但是长期受到脉冲电场影响的情况，都不具备可逆性。发生不可逆击穿之后，细胞膜内外的物质将会自由地交换，最终使细胞死亡。研究表明，跨膜电压大于1 V时，酵母菌便会死亡[16]。

图9 电崩解过程示意图Fig.9 Schematic diagram of electric disintegration process

4.2 酵母菌跨膜电压分析

4.2.1 酵母菌跨膜电压数学模型

基于电崩解理论，对酵母菌的跨膜电压进行分析计算，为了降低分析的复杂度，采用正球形的酵母菌模型如图10所示。在构建模型时，对酵母菌细胞各个部分的参数进行合理设置，其中细胞膜内、外半径依次表示为rz、rc，细胞质的介电常数和电导率为εz、σz，细胞膜的介电常数和电导率为εm、σm，咖啡液的介电常数和电导率为εc、σc，电场方向与细胞膜上点的法线夹角为θ。

图10 酵母菌单细胞理想模型Fig.10 Ideal single cell model of yeast

在研究过程中假设细胞质以及细胞膜结构属于线性、各向同性材料，细胞膜相对介电常数较小，可以等效为绝缘球壳，所以各个点的电势符合Laplace方程，在球坐标系下的具体形式如下所示[17]:

(6)

以细胞中心O为原点，高压脉冲电场的方向为从左向右，利用分离变量法将式(6)转换为Legendre方程，根据膜电势的实际情况，结合Legendre方程的解可以得到酵母菌各个位置上的电势：

(1)当0

(7)

(2)当rz≤r≤rc时

(8)

(3)当rc

(9)

式中，Pn为勒让德函数；An、Bn、Cn、Dn为和n有关的系数，结合式(2)进行求解。根据参考文献[18]中的求解过程，即可得到各个位置的电势。跨膜电压为细胞膜内侧电势Фz、外侧电势Фc形成的电势差，可以表示为ΔФm。解得电极间距为d的处理腔中，位于距离轴心r的单个酵母菌跨膜电压如下所示：

ΔΦm=

(10)

4.2.2 酵母菌跨膜电压仿真模型

为了仿真分析酵母菌跨膜电压，本实验使用Comsol Multiphysics仿真软件，根据式(10)构建仿真模型，仿真计算参数[19]见表3。

表3 酵母菌细胞参数Tab.3 Yeast cell parameters

酵母菌细胞等效为正球形，所以使用二维模型即可准确反应跨膜电压分布情况。

取处理腔轴心垂直方向的截面，其中H为高压电极，N为接地电极，在高压电极上施加6 kV的脉冲电压，仿真得到电场强度分布如图11所示[20]。

图11 脉冲电压6 kV处理腔电场强度分布Fig.11 Electric field intensity distribution of 6 kV applied voltage treatment chamber

由处理腔电场强度分布可知，紧靠接地电极处电场强度最小，如果位于最小场强处的某个酵母菌，跨膜电压能达到发生电崩解的临界值，即可说明在处理腔其他任意位置的酵母菌，跨膜电压都大于临界值，高压脉冲电场可以有效灭杀酵母菌。

为了获得与图10中相同方向的电场，酵母菌细胞位置选择在处理腔内部右侧，且紧靠接地电极，选取的酵母菌位置如图12所示。在此位置上的酵母菌单细胞，细胞膜的电场强度分布如图13所示。

图12 酵母菌在处理腔中的位置Fig.12 Position of yeast in treatment chamber

图13 酵母菌细胞膜电场强度分布Fig.13 Electric field intensity distribution of yeast cell membrane

在二维平面上，酵母菌细胞等效为两个半径不等的同心圆，内、外半径分别为rz、rc，细胞膜内外侧电势分别为Фz、Фc。

4.2.3 高压脉冲电场灭菌的可行性

以细胞膜上A点为起始点，顺时针旋转θ度，0°<θ<360°，计算所有角度上Фz、Фc差的绝对值，得到的值即为跨膜电压ΔФm。单个酵母菌细胞跨膜电压分布如图14所示。

图14 酵母菌细胞跨膜电压分布曲线Fig.14 Transmembrane voltage distribution curve of yeast cells

通过模拟仿真结果可得，位于处理腔接地电极附近的酵母菌细胞，最大跨膜电压仍可达1.772 V。即在处理腔的任意位置，酵母菌在高压脉冲电场下的跨膜电压都大于1 V，细胞膜发生不可逆击穿，酵母菌细胞死亡[21]。说明本文中搭建的高压脉冲电场灭菌装置可以应用于咖啡液灭杀酵母菌。

4.2.4 脉冲电压幅值与酵母菌残活率的关系

改变脉冲电压幅值，计算同一位置上单个酵母菌的最大跨膜电压，计算结果如图15所示。

图15 跨膜电压与脉冲电压关系Fig.15 Relationship between transmembrane voltage and pulse voltage

脉冲电压越大，固定位置上单个酵母菌的跨膜电压越大。根据电崩解理论，跨膜电压越大，细胞膜越容易发生不可逆击穿，酵母菌越容易致死，酵母菌残活率越低[22]。可以得到结论，脉冲电压越大，酵母菌残活率越低，和实验结果相一致。

通过仿真可以分析不同位置、不同脉冲电压、不同体积的酵母菌跨膜电压分布规律，仿真结果与实验结果相符合。利用仿真指导后续实验，可以降低实验的时间和经济成本。

5 结论

(1)采用高压脉冲电场技术，可以灭杀咖啡液中的酵母菌。实验表明：酵母菌的残活率随脉冲电压的增大而降低，随充电电容的增大而降低，随脉冲时间的增加而降低。

(2)酵母菌在高压脉冲电场作用下死亡，是因为跨膜电压的存在。利用分离变量法求解Laplace方程可以求得单个酵母菌跨膜电压公式，以此为基础可以进行仿真分析。

(3)利用Comsol建立酵母菌细胞电场模型，可求得不同脉冲电压下酵母菌细胞的跨膜电压，仿真结果与实验结果一致，可以通过仿真对后续实验进行指导和改进。