宫颈癌中影响预后的生物分子及免疫细胞浸润

苏亚妮，杨明义，何昌军，雷 侠，常 宇，胡云峰*

(1.延安大学附属医院放疗科，陕西 延安 716000;2.延安大学医学院，陕西 延安 716000)

宫颈癌是一种常见的女性癌症[1-2]，发病率和病死率很高。由于基因测序的蓬勃发展，基因表达综合数据库(gene expression omnibus,GEO)在生物信息学分析中的作用越来越重要。抑制素βA(inhibin beta A，INHBA)是转化生长因子β超家族的一个配体[3]。目前，发现INHBA的高表达与胃癌[4]、白血病[5]、前列腺癌[6]、头颈部鳞癌[7]等多种癌症有关。然而，尚无关于INHBA在宫颈癌中生物学功能的相关研究。免疫细胞浸润是指免疫细胞从血液中移向组织发挥抗肿瘤作用。浸润肿瘤的免疫细胞对肿瘤的发展和抗癌治疗的成功具有深远的影响。已有研究发现头颈部鳞癌中免疫细胞的浸润与INHBA相关，免疫浸润的B细胞影响预后[7]。然而，INHBA在宫颈癌中与免疫细胞浸润的关系少见报道。

1 资料与方法

1.1微阵列数据 GEO(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)是当今最大、最全面的公共数据资源。从GEO下载GSE9750基因表达数据集。GSE9750数据集中包含有42例宫颈癌样本和24例正常宫颈组织样本。平台是GPL96Array芯片数据。

1.2鉴定差异表达基因(differentially expressed genes，DEGs) R是用于统计分析、绘图的语言和操作环境，是一个自由、免费、源代码开放的软件，是一个用于统计计算和统计绘图的优秀工具。Perl与脚本语言一样，不需要编辑器和链接器来运行代码，只需写出程序并告诉Perl来运行。将从GEO下载的GSE9750数据集用Perl进行注释，将基因ID转换成基因symbol；并用Perl对数据进行分组整理。R进行数据的批次校正，R的“limma”包鉴定DEGs，筛选标准：P<0.05、logFC≥1/logFC≤-1。

1.3DEGs的基因本体论(gene ontology, GO)和京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)富集分析 GO由基因本体联盟管理和更新，GO数据库建立一套描述基因及其产物功能的标准词汇体系/术语(term)。GO富集分析是找出目标基因集中最显著的GO term。KEGG是一个整合了基因组、化学和系统功能信息的数据库，是一个生物系统的计算机模拟。R的 “clusterProfiler”包对DEGs进行GO和KEGG富集，选取标准为P<0.05。

1.4蛋白-蛋白互作(protein-protein interaction，PPI)网络的构建 STRING(http://string-db.org)是一个在线搜索已知蛋白互作关系的数据库，可以对互作基因网络进行预测，为了解疾病产生或发展的机制提供更加深入的科学依据。利用STRING构建INHBA的PPI网络，综合评分>0.4的交互作用被认为有统计学意义。

1.5INHBA在宫颈癌的表达和预后 基因表达谱交互式分析(gene expression profiling interactive analysis，GEPIA)数据库汇集了癌症基因组图谱(the cancer genome atlas，TCGA)和基因型和基因表达量关联数据库(the genotype-tissue expression，GTEx)数据库中306例宫颈癌及13例正常宫颈上皮的测序数据。我们用GEPIA数据库分析INHBA在宫颈癌的表达和预后情况。

1.6宫颈癌中样本的免疫细胞浸润 GSE9750数据集的表达矩阵在R中经“e1071”、“parallel”和“preprocessCore”包用“CIBERSORT”软件获得免疫细胞表达矩阵。Perl筛选免疫细胞矩阵中P<0.05的样本，并用R进行可视化。

1.7细胞类型表达水平分析 GEPIA上通过交互箱线图将选择的每个细胞类型的基因表达可视化，并进行细胞类型水平差异表达分析。与比例分析类似，输入目标基因即可得到该基因在所选肿瘤中，各种免疫细胞中的表达水平。

1.8统计学方法 应用R软件(4.1.1版本)进行数据分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1宫颈癌的潜在生物学分子

2.1.1DEGs的鉴定 R的 “limma”包鉴定出1 485个DEGs,包括752个上调DEGs和733个下调DEGs。R对DEGs可视化火山图(图1A)和热图(图1B)。

图1 差异表达基因

2.1.2DEGs的GO富集分析 R的“clusterProfiler”包进行GO富集，选取标准为P<0.05。GO显著富集情况见表1。

表1 差异基因的GO富集分析

2.1.3DEGs的KEGG富集分析 R的“clusterProfiler”包进行KEGG富集，选取标准为P<0.05。KEGG显著富集见表2。

表2 差异基因的KEGG 富集分析

2.1.4PPI网络的构建STRING构建 INHBA的PPI网络，共11个节点，43条边,平均节点度7.82,PPI富集P=3.04e-14。PPI富集相互作用的蛋白有ACVR1、ENG、ACVRL1、ACVR2B、FSTL3、ACVR1B、INHA、ACVR1C、FST、ACVR2A(图2)。

图2 INHBA基因PPI蛋白互作网络的构建

2.1.5INHBA在宫颈癌中表达增高并导致不良预后 INHBA在GEPIA数据库的分析发现相对于正常样本来说，INHBA在宫颈癌中表达升高(P<0.05，图3A)。根据KM生存分析，低表达INHBA组的预后较好(P=0.01，图3B)。

图3 INHBA在宫颈癌的表达增高并导致不良预后

2.2宫颈癌免疫细胞浸润

2.2.1宫颈癌中免疫浸润细胞相关性分析 R的“corrplot”包制作相关性热图(图4)，结果显示未活化的CD4+记忆性T细胞和未活化的树突状细胞呈正相关(相关系数=0.64)，两者具有协同效应。未活化的树突状细胞和浆细胞呈负相关(相关系数=0.49)，两者具有拮抗作用。

图4 宫颈癌中免疫细胞的相关性热图

2.2.2免疫浸润细胞在宫颈癌和宫颈正常上皮中的表达情况 对筛选后的免疫细胞矩阵用R的“vioplot”包进一步可视化小提琴图，发现初始CD4+T细胞(P=0.001)、未活化的自然杀伤细胞(P=0.047)、M0巨噬细胞(P<0.001)、M1巨噬细胞(P=0.007)在宫颈癌样本中表达升高，而未活化的CD4+记忆性T细胞(P<0.001)、单核细胞(P<0.001)、未活化的树突状细胞(P<0.001)在宫颈癌样本中表达明显降低(图5)。

图5 免疫浸润细胞在宫颈癌和宫颈正常上皮中的表达情况

2.2.3细胞类型表达水平分析 通过交互箱线图将选择的每个细胞类型的基因表达可视化，并进行细胞类型分析INHBA在宫颈癌各种免疫细胞中的表达水平。结果表明,在宫颈癌中INHBA基因在成纤维细胞中含量最高,在自然杀伤细胞和内皮细胞含量最低(图6)。

图6 宫颈癌中各种免疫细胞中INHBA的表达水平

3 讨 论

宫颈癌是女性的杀手，在女性肿瘤中占有很大的地位，对女性的身心健康有严重影响。然而其发病机制尚不明确。生物信息学为鉴定疾病的生物标志物及相关途径提供了一种强有力的方法，进一步推动了疾病病因及发病机制的研究。本研究通过生物信息学分析发现INHBA在宫颈癌中高表达。通路显著富集于细胞周期、DNA复制、P53信号通路、卵母细胞减数分裂、白细胞介素17信号通路、细胞衰老等。免疫细胞分析显示，初始CD4+T细胞，未活化的自然杀伤细胞，M0巨噬细胞和M1巨噬细胞在宫颈癌样品中表达明显升高。而未活化的CD4+记忆性T细胞、单核细胞、未活化的树突状细胞在宫颈癌样本中表达明显降低。

研究发现INHBA在头颈部鳞癌中的过表达对转录后的调控具有深远的影响，与蛋白质翻译密切相关[7]。此外，INHBA的高表达与疾病的恶性程度有关，其在胃癌[4]、食管癌[8]、前列腺癌[6]、头颈部鳞癌[7]、白血病[5]、鼻咽癌[9]、卵巢癌[10]和结直肠癌[11-12]等肿瘤中的表达明显升高。本研究结果显示，宫颈癌组织中的INHBA表达显著高于正常组织，INHBA可能在宫颈癌中发挥癌基因作用。研究发现在结肠癌患者中，INHBA高表达组患者的生存周期显著低于低表达组[3]。在头颈部鳞癌中，免疫浸润的B细胞影响预后，并可能与INHBA的表达情况有关[7]。INHBA高表达不仅是急性髓系白血病的不良预后因素,而且与急性髓系白血病的临床特征相关[5]。在食管鳞癌中INHBA高表达提示不良预后[8]。INHBA对胃癌[13]、乳腺癌[14]和结直肠癌[11]的预后都有一定的指导意义。INHBA在卵巢癌中特异性表达，高表达患者的死亡风险增高[10]。INHBA也与鼻咽癌的预后相关[9]。INHBA在大肠癌中显著上调，INHBA的高表达与大肠癌患者的不良预后密切相关[15]。虽然INHBA与多种肿瘤的预后相关，但其在宫颈癌中与预后的关系还不明确。本研究发现INHBA高表达导致宫颈癌的预后不良，将是一个新的研究方向。

研究发现INHBA在头颈部鳞癌中的表达与免疫浸润细胞(B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞)的丰度之间具有相关性，免疫浸润的B细胞与INHBA在头颈部鳞癌中表达与生存有关，说明B细胞显著影响预后，值得进一步研究和探索[7]。可见免疫浸润的B细胞在头颈部鳞癌中的预后价值可能与INHBA相关[7]。此外，研究表明INHBA在头颈部鳞癌的过表达与转录后蛋白质翻译密切相关，与INHBA相关的微核糖核酸的分子功能主要在转录因子活性和转录调节活性上得到增强。但INHBA与宫颈癌免疫细胞浸润的相关性目前尚无明确的报道。本研究结果表明初始CD4+T细胞、未活化的自然杀伤细胞、M0巨噬细胞和M1巨噬细胞在宫颈癌样本中表达升高。而未活化的CD4+记忆性T细胞、单核细胞和未活化的树突状细胞在宫颈癌样本中表达降低。未活化的CD4+记忆性T细胞和未活化的树突状细胞呈正相关，两者具有协同效应。未活化的树突状细胞和浆细胞呈负相关，两者具有拮抗作用。但免疫细胞之间的协同和拮抗关系的具体机制还有待进一步探索。

本研究探讨INHBA在宫颈癌中的预后情况以及宫颈癌中的免疫浸润细胞，对宫颈癌的预后研究及临床治疗具有一定的指导意义。