QuEChERS-超高效液相色谱法测定谷物及油籽中氰氟草酯和氰氟草酸残留量

彭红霞，刘 娅，杨 丽 ，吕新明，徐新忠，徐 鑫，王 珂

（1.石河子大学食品学院，新疆石河子 832000；2.阿拉山口海关技术中心，新疆阿拉山口 833418；3.哈密市市场监督管理局，新疆哈密 839000）

氰氟草酯（Cyhalofop-butyl）是一种芳氧苯氧羧酸酯类除草剂，其商品名为千金（Clincher），代号为XDE-537，化学名称为（R）-2-[4（4-氰基-2-氟苯氧基）苯氧基]丙酸丁酯[1−2]。氰氟草酸（Cyhalofop-acid）是氰氟草酯的主要代谢产物，也是除草活性物质[3]。氰氟草酯和氰氟草酸在禾本科杂草中使用后，很快分解为能抑制杂草中乙酰辅酶A 羧化酶的杀草活性化合物，阻止脂肪酸的合成，起到除草的作用[4−7]。

氰氟草酯和氰氟草酸属于含氟农药，在现代农业中，含氟农药已广泛应用于霉菌、害虫、杂草的防治，以提高蔬菜、水果和农作物的生产力和品质。由于使用量大，含氟农药经常在农产品中检出，并通过食物链的积累对人体健康构成威胁，过量摄入氟化物会导致骨氟中毒、尿石症、急性胃炎、肾脏损害，甚至癌症等[8]。因此，氰氟草酯和氰氟草酸的定量测定和监测对人类健康具有重要意义。但是，我国目前几乎没有关于同时测定植物源性食品中氰氟草酯和氰氟草酸残留量的标准。国家标准GB 23200.4（原检验检疫行业标准SN/T 1737.4）《食品安全国家标准除草剂残留量检测方法第4 部分：气相色谱-质谱/质谱法测定食品中芳氧苯氧丙酸酯类除草剂残留量》中，采用气相色谱-质谱/质谱法测定氰氟草酯，但未涉及氰氟草酸的测定方法；日本检测标准JAP-113《氰氟草酯和二甲吩草胺检测方法》中，采用气相色谱法和气相色谱质谱/质谱法进行定量与确证氰氟草酯，仍未涉及氰氟草酸的测定方法；欧盟农药残留限量标准对谷物和果蔬均有限量，其中谷物限量为0.02 mg/kg，油料限量为0.05 mg/kg。

在科研领域，氰氟草酯的测定方法包括高效液相色谱法（HPLC）[9−10]、液相色谱质谱/质谱法（LCMS/MS）[11]、气相色谱法（GC-ECD）[12]和气相色谱质谱/质谱法（GC-MS/MS）[13−14]，但是同时测定氰氟草酯和氰氟草酸残留量的报道也较少，加之粮谷类等植物源性食品[15]的基质成分很复杂、干扰杂质很多，因此，找到一个高效、合理的前处理方法是必要的。2003 年赵莉等[9]和2017 年董婷等[16]探索了稻田水、土壤等中的氰氟草酯及其代谢化合物的残留量的检测方法，但其使用的二氯甲烷萃取法速度较慢。2017 年，孙明娜等[17]运用高效液相色谱-串联色谱技术，选择不同的离子源，检测稻田水和土壤中的氰氟草酯和氰氟草酸，但离子源的更换导致检测过程有诸多不便。Anastassiadas 等[18]确立的分散固相萃取（QuEChERS）技术后被优化推广，称得上是快速农残检测的首选前处理技术[19−23]。2019 年，李菊颖等[24]使用QuEChERS 前处理方法检测了田水、土壤、水稻植株、水稻稻壳和糙米中的氰氟草酯和氰氟草酸的残留量，但涉及的样品种类少。

本实验经过优化QuEChERS 各类填料的配比、提取和净化体系，调整超高效液相色谱的色谱条件，创建了一种准确、高效的QuEChERS-UPLC 分析方法，该方法能够同时检测谷物类的大米、玉米、大麦、小麦、燕麦和油籽类的花生、大豆等植物源性食品中氰氟草酯和氰氟草酸的残留量，为进出口食品安全检测工作提供了技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大米、玉米、燕麦、小麦、大麦、大豆、花生 市售，经研磨器粉碎后备用；氰氟草酯标准品 纯度99.37%，Dr. Ehrenstorfer Gmbh；氰氟草酯标准品纯度99.9%，Dr. Ehrenstorfer Gmbh；甲醇、乙腈 色谱纯，上海西格玛奥德里奇；N-丙基乙二胺（PSA）、C18北京振翔科技；氯化钠 分析纯，天津光复科技；无水硫酸镁 分析纯，天津致远；磷酸 分析纯，天津风船；甲酸 分析纯，上海西格玛奥德里奇；QuEChERS 萃取盐包 内容物：无水硫酸镁、醋酸钠美国安捷伦；超纯水 电阻率18.2 MΩ·cm，25 ℃。

ACQUITY UPLC 超高效液相色谱仪 美国Waters 公司；Cascada I 实验室超纯水机 美国Pall公司；Mult7 Reax 试管振荡器 德国Heidolph 公司；DTC-27F 多功能静音型超声波清洗机 湖北鼎泰公司；超越系列XP 分析天平 瑞士梅特勒-托利多公司；CF16RN 多用途冷冻离心机 日本Himac 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品前处理

1.2.1.1 提取 准确称取大米、玉米、燕麦、小麦、大麦、大豆和花生样品2~5 g，依次添加10 mL 0.1%甲酸水（体系pH 在2~3 之间）、10 mL 乙腈、6 g 氯化钠、2 g 无水硫酸镁，振荡2 min，在10000 r/min、2 ℃条件下高速冷冻离心5 min[24−26]。离心后取全部上清液，于−18 ℃环境下保存3 h，待净化[27]。

1.2.1.2 净化 分别吸取经提取后的上层乙腈层各1 mL 到净化管中，依次添加20 mg C18、50 mg PSA、150 mg 无水硫酸镁，振荡2 min，在5000 r/min、2 ℃条件下冷冻离心5 min。其上清液经0.22 μm 滤膜过滤后供UPLC 分析[28−29]。

1.2.2 溶液的配制和标准曲线的绘制 标准储备溶液的配制：分别称量氰氟草酯和氰氟草酸标准品10 mg 到10 mL 含有甲醇的容量瓶中，超声使其充分溶解，定容，配制成1000 μg/mL 的标准储备溶液，并在−18 ℃环境中进行贮存[30]。

混合标准使用液的配制：分别吸取100 μL 的氰氟草酯和氰氟草酸标准储备液于1 mL 的试剂瓶中，用乙腈进行稀释，使其成为100 μg/mL 的混合标准使用液，在低温下放置，备用。

0.1%甲酸水的配制：准确吸取1 mL 甲酸，用超纯水定容至1000 mL，低温下放置，备用。

空白基质溶液的配制：准确称取未检出氰氟草酯和氰氟草酸残留的大米、玉米、燕麦、小麦、大麦、大豆和花生样品，根据1.2.1 的方法，制得空白基质溶液。

溶剂标准曲线和基质匹配标准曲线绘制：分别用乙腈和空白基质溶液稀释混合标准使用液，制得质量浓度为0.002、0.005、0.01、0.02、0.1、2、5 μg/mL的溶剂标准溶液和基质匹配标准溶液，分别进样分析，外标法定量。以质量浓度为横坐标（x），峰面积为纵坐标（y），绘制溶剂标准曲线和各物质的基质匹配标准曲线。

1.2.3 样品前处理的优化

1.2.3.1 检测样品取样量的选择 分别准确称取大米、玉米、燕麦、小麦、大麦、大豆和花生样品各2 g 和5 g，谷物和油料分别加标0.01 μg/mL 和0.02 μg/mL后进行前处理，考察氰氟草酯和氰氟草酸的提取回收率。

1.2.3.2 提取剂的选择 准确称取大米、玉米、燕麦、小麦、大麦、大豆和花生样品加标后进行前处理，在提取过程中，选择酸化甲醇、酸化乙腈、甲醇-0.1%甲酸水（1:1，V/V）、乙腈-0.1%甲酸水（1:1，V/V）及甲醇-乙腈-0.1%甲酸水（0.5:0.5:1，V/V/V）作为提取溶剂，分别考察氰氟草酯和氰氟草酸的提取回收率。

1.2.3.3 提取体系pH 的选择 准确称取大米、玉米、燕麦、小麦、大麦、大豆和花生样品加标后进行前处理，在提取过程中，调节体系pH，分别考察氰氟草酯和氰氟草酸的提取回收率。由于氰氟草酯在pH=4.0 时稳定，且根据董婷等[16]的实验结果，萃取体系的pH 在2.5~3.0 时，可以得到较高的回收率且提取组分的杂质较少，故pH 取值1.5、2.5、3.5、4.5、5.5。

1.2.3.4 盐析剂的选择 准确称取大米、玉米、燕麦、小麦、大麦、大豆和花生样品加标后进行前处理，在提取过程中，分别选择氯化钠和内容物为无水硫酸镁和醋酸钠的QuEChERS 萃取盐包将水层与有机层分离，考察氰氟草酯和氰氟草酸的提取回收率。

1.2.3.5 吸附剂的选择 准确称取大米、玉米、燕麦、小麦、大麦、大豆和花生样品加标后进行前处理，在净化过程中，分别选择C18和PSA、PSA 作为吸附剂，考察氰氟草酯和氰氟草酸的提取回收率。

1.2.4 色谱条件 在董婷等[16]研究的基础上进行了优化，氰氟草酯和氰氟草酸得到很好的分离，出峰时间分别在7.10~7.20 min 和3.61~3.71 min，故采取以下的色谱条件。色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18（50 mm×2.1 mm, 1.7 μm）；流动相：A 为甲醇，B 为乙腈，C 为0.1%磷酸水溶液，采用梯度洗脱，具体见表1；流速：0.3 mL/min；进样量：2 μL；柱温：40 ℃；样品温度：15 ℃；检测波长：248 nm。

表1 超高效液相色谱梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution program of UPLC

1.2.5 回收率的测定 准确称取未检出氰氟草酯和氰氟草酸残留的大米、玉米、燕麦、小麦、大麦、大豆和花生样品，分别添加定量限1 倍、2 倍、10 倍质量浓度的氰氟草酯和氰氟草酸标准溶液，使用1.2.1 的方法处理后按 1.2.4 的色谱条件进行检测，平行检测6 次，计算加标回收率和相对标准偏差RSD（%）。

1.3 数据处理

使用Empower 3 （Waters，USA）和Origin 2017软件采集、处理和分析数据。

2 结果与分析

2.1 样品前处理的优化

2.1.1 样品取样量的选择 参考GB 23200.113-2018《食品安全国家标准植物源性食品中208 种农药及其代谢物残留量的测定气相色谱-质谱联用法》，样品取样量一般为2.0 g 和5.0 g，故本实验通过比较样品取样量在2.0 g 和5.0 g 时，氰氟草酯和氰氟草酸的回收率，确定最佳的样品取样量。实验表明，对于小麦、大麦、燕麦、花生和大豆样品，取样量为2.0 g时，氰氟草酯和氰氟草酸的回收率高，取样量为5.0 g时，提取体系过于粘稠，导致提取不充分，使得回收率降低，因此以上5 种样品选择取样量为2.0 g。对于大米与玉米样品，取样量对待测物的回收率影响较小，由于取样量为5.0 g 时回收率相对偏高，故选择取样量为5.0 g。结果见图1。

图1 检测样品取样量的选择Fig.1 Selection of sampling amount of test sample

2.1.2 提取剂的选择 选择酸化甲醇、酸化乙腈、甲醇-0.1%甲酸水（1:1，V/V）、乙腈-0.1%甲酸水（1:1，V/V）及甲醇-乙腈-0.1%甲酸水（0.5:0.5:1，V/V/V）作为提取溶剂，考察在总量保持不变的前提下，不同提取剂对提取回收率的影响。结果见图2，提取剂为乙腈-0.1%甲酸水（1:1，V/V）时，各样品的回收率显然高于其余几种，此时氰氟草酯和氰氟草酸的回收率分别为89.69%~98.00%和86.88%~96.30%，比回收率最低的甲醇-0.1%甲酸水（1:1，V/V）作为提取剂时分别高出16.68%~20.88%和15.66%~21.20%。此外，提取剂选择乙腈比选择甲醇的提取效果好，证实了Lehotay 等[31−33]提出的，与其他溶剂相比，乙腈对大多数化合物具有适当的极性，产生更好的回收率和相容性。故选择乙腈-0.1%甲酸水（1:1，V/V）作为提取溶剂。

图2 提取剂的选择Fig.2 Selection of extractants

2.1.3 提取体系pH 的选择 本实验考察提取体系不同pH 对提取回收率的影响，结果见图3，提取体系pH 在2.5 和3.5 时，氰氟草酯和氰氟草酸的回收率较高，在1.5 和5.5 时较低，原因可能是，氰氟草酸在水中呈离子状态，很难被有机溶剂提取，酸性体系可提高其提取率。赵莉等[34]的实验也表明氰氟草酯在酸性条件下是比较稳定的，而在微酸性及中性条件下水解速度加快，在碱性条件下水解迅速。所以选择整个萃取体系的pH 为2.5~3.5。

图3 提取体系pH 的选择Fig.3 Selection of the pH of the extraction system

2.1.4 盐析剂的选择 在提取过程中，为了得到澄清的萃取液，要通过盐析作用使水层与乙腈层分离[35]。在本实验中，分别选择氯化钠和内容物为无水硫酸镁和醋酸钠的QuEChERS 萃取盐包作为盐析剂，考察提取回收率。从图4 可以看出，各样品在提取过程中，使用氯化钠作为盐析剂的体系，氰氟草酯和氰氟草酸的回收率分别为92.68%~101.11%和89.65%~99.20%，比使用QuEChERS 萃取盐包的体系分别高出18.56%~18.88%和17.54%~20.08%。QuEChERS萃取盐包中含有无水硫酸镁和醋酸钠，前者可除去样品基质中的水分，后者可提供适宜pH，使得碱敏感的氰氟草酯和氰氟草酸能有较好的回收率，但由于体系含水量较大，盐与水反应放热，导致氰氟草酯和氰氟草酸分解，从而导致回收率偏低。因此，选择氯化钠作为盐析剂。

图4 盐析剂的选择Fig.4 Selection of salting-out agents

2.1.5 吸附剂的选择 在本实验中，分别选择C18和PSA 作为吸附剂，考察同时使用PSA 和C18作为吸附剂和仅使用PSA 作为吸附剂时，各样品氰氟草酯和氰氟草酸的提取回收率。实验表明，吸附剂的种类对大米、玉米、燕麦、小麦和大麦中氰氟草酯和氰氟草酸的回收率影响不大，但对油籽类花生和大豆中氰氟草酯和氰氟草酸的回收率影响较大，同时使用PSA 和C18时，氰氟草酯和氰氟草酸的回收率比单独使用PSA 时，花生分别高出9.77%和10.63%，大豆分别高出11.16%和10.74%。因为，PSA 可除去有机酸、脂肪酸、糖类等，C18可除去脂质、色素等[36−37]，在测定油籽类的花生、大豆样品时，若不加入C18，脂质将会干扰氰氟草酯和氰氟草酸的测定，导致回收率降低。由此得出，同时测定谷物和油料样品时，需要同时加入PSA 和C18作为吸附剂；若只测定谷物类样品，可考虑不加C18。由于本实验需要同时测定谷物类和油籽类样品，故选择PSA 和C18同时作为吸附剂。结果见图5。

图5 吸附剂的选择Fig.5 Selection of adsorbents

2.2 基质效应、线性关系、检出限和定量限

样品中存在与目标化合物结构、性质相似的基质成分，在样品制备过程中也会被提取出来，这些基质成分会干扰分析过程，影响结果准确性，这种现象便是基质效应[38]。实验中以ME（%）=（1−K1/K2）×100计算基质效应[39]，其中，ME 为基质效应，K1为基质匹配标准曲线的斜率，K2为溶剂标准曲线的斜率。根据1.2.2，用乙腈和7 种样品的空白基质溶液分别稀释氰氟草酯和氰氟草酸的混合标准使用液，得到溶剂标准曲线和基质匹配标准曲线。以3 倍信噪比（S/N≥3）和10 倍信噪比（S/N≥10）分别确定检出限（LOD）与定量限（LOQ）[30]。

结果见表2，在乙腈、大米、小麦、大麦、玉米、燕麦、花生、大豆中，氰氟草酸和氰氟草酯在0.002~5 μg/mL 的浓度范围的峰面积与质量浓度间呈良好的线性关系，相关系数（r）都大于0.9987。7 种样品的基质效应都在0~20%之间，说明基质效应对定量检测的影响不显著，可以忽略[24,40]。检出限（LOD）在0.002~0.005 mg/kg 之间，定量限（LOQ）在0.01~0.02 mg/kg 之间。

表2 氰氟草酯和氰氟草酸的线性方程、相关系数、基质效应、检出限、定量限Table 2 The linear equation, correlation coefficient, matrix effect, detection limit, quantification limit of cyhalofop-butyl and cyhalofop-acid

2.3 方法的回收率与精密度

取未检出农药残留的大米、玉米、燕麦、小麦、大麦、大豆和花生样品，分别添加定量限1 倍、2 倍、10 倍质量浓度的氰氟草酯和氰氟草酸标准溶液，即谷物添加浓度为0.01、0.02、0.1 μg/mL，油籽添加浓度为0.02、0.04、0.2 μg/mL，使用1.2.1 的方法处理后按 1.2.4 的色谱条件进行检测，平行检测6 次。结果见表3，大米、玉米、燕麦、小麦和大麦中氰氟草酯和氰氟草酸的回收率范围为89.23%~101.12%和87.98%~100.02%，空白基质和加标样品谱图见图6和图7（以玉米为例）；花生和大豆中氰氟草酯和氰氟草酸的回收率范围为85.12%~92.34%和82.63%~89.55%，空白基质和加标样品谱图见图8 和图9（以花生为例）；所有样品的相对标准偏差（RSD）为1.1%~3.3%。该方法的准确性和重复性良好。

图6 玉米空白谱图Fig.6 Blank spectrum of corn

图7 玉米添加样品谱图（0.01 μg/mL）Fig.7 Spectra of corn added samples (0.01 μg/mL)

图8 花生空白谱图Fig.8 Blank spectrum of peanut

图9 花生添加样品谱图（0.02 μg/mL）Fig.9 Spectra of peanut added samples (0.02 μg/mL)

表3 氰氟草酯和氰氟草酸的添加回收率和相对标准偏差（n=6）Table 3 Addition recovery rate and relative standard deviation of cyhalofop-butyl and cyhalofop-acid (n=6)

2.4 实际样品测定

随机抽取新疆维吾尔自治区博尔塔拉蒙古自治州大米、玉米、燕麦、小麦、大麦、花生和大豆样品各20 份进行检测，结果见表4。可以看出，7 种样品中，氰氟草酯在大米、玉米、小麦、大麦和大豆中均有检出，检出率在10%~45%之间，平均残留量在0.0026~0.0079 mg/kg 之间，燕麦和花生样品均未检出；氰氟草酸在大米、小麦、大麦和大豆中均有检出，检出率在5%~40%之间，平均残留量在0.0029~0.0062 mg/kg 之间，玉米、燕麦和花生样品均未检出。本实验中，谷物类样品的氰氟草酯最大残留量为0.0093 mg/kg，氰氟草酸最大残留量为0.0085 mg/kg；油籽类样品的氰氟草酯最大残留量为0.0089 mg/kg，氰氟草酸最大残留量为0.0084 mg/kg，均小于我国和欧盟对谷物及油籽的限量规定。部分样品的色谱分析图见图10。

表4 氰氟草酯和氰氟草酸在7 种样品中的检出率及浓度范围Table 4 Detection rate and concentration range of cyhalofop butyl and cyhalofop-acid in 7 samples

图10 实际样品谱图Fig.10 Spectra of practical samples

3 结论

本研究通过优化QuEChERS 前处理方法和分析基质效应对测定氰氟草酯和氰氟草酸残留量的影响，使用UPLC 分析检测，外标法定量，建立了一种能同时检测植源性食品中氰氟草酯和氰氟草酸残留量的方法。在乙腈和7 种样品中，氰氟草酸和氰氟草酯在0.002~5 μg/mL 的浓度范围内的峰面积与质量浓度间呈良好的线性关系，相关系数（r）都大于0.9987。大米、玉米、燕麦、小麦和大麦中氰氟草酯和氰氟草酸的回收率范围为89.23%~101.12%和87.98%~100.02%，检出限为0.002 mg/kg，定量限为0.01 mg/kg；花生和大豆中氰氟草酯和氰氟草酸的回收率范围为85.12%~92.34%和82.63%~89.55%，检出限为0.005 mg/kg，定量限为0.02 mg/kg；所有样品的相对标准偏差（RSD）为1.1%~3.3%。该方法在实际检测中具有较强的可行性和实用性，可以满足谷物类和油籽类样品中氰氟草酯和氰氟草酸的监测要求。

该检测方法的前处理过程较二氯甲烷萃取法等更加简单、快速，并且能同时检测谷物和油籽中氰氟草酯和氰氟草酸的残留量，灵敏度和准确度达到了农残检测的要求，是一种高效的方法，适用于氰氟草酯和氰氟草酸在谷物及油籽中的日常检测。此外，对于其它与大米、玉米、燕麦、小麦、大麦、花生和大豆具有相似化学成分的食品中的氰氟草酯和氰氟草酸残留研究具有参考意义。