双壳贝类净化技术研究进展

林恒宗，高加龙,4，范秀萍,4，林海生,4，曹文红,4，梁志源，黄艳平，章超桦,4，秦小明,4,

（1.广东海洋大学食品科技学院，广东湛江 524025；2.国家贝类加工技术研发分中心（湛江），广东湛江 524025；3.广东省水产品加工与安全重点实验室，水产品深加工广东普通高校重点实验室，广东湛江 524025；4.广东省海洋食品工程技术研发中心，海洋生物制品工程重点实验室，广东湛江 524025）

我国是贝类养殖大国，贝类年产量已连续多年位居世界首位。据《中国渔业统计年鉴》显示，2019年我国贝类产量高达1439 万吨，占世界贝类总年产量的60%以上[1]。近年来，由于海洋污染加剧，贝类生存环境受到挑战，双壳贝类作为一种滤食性生物极易吸附海洋中的有毒污染物，如致病菌、贝类毒素、重金属和农药残留物等，并进一步在体内多种生物酶的催化下发生转化和代谢，食用后对人体健康造成极大威胁。日本、加拿大、法国等多个国家均有关于消费者因食用不洁净贝类而引起的大面积中毒感染现象的报道[2]，同时贝类污染也一直制约着我国产业发展和国际贸易。因此，鲜活贝类在进入市场前进行净化显得尤为重要。

目前，国内外关于双壳贝类净化方法可归结为灭菌海水暂养净化、物理吸附法、化学降解法和生物代谢法等，各种净化方法都有其独特的优势与局限性。传统技术，如采用紫外线、臭氧、氯气对暂养净化海水进行灭菌，该方法对受到致病性微生物污染的贝类有较好的净化效果，但对受到重金属（heavy metals，HMs）、持久性有机物（persistent organic pollutants，POPs）、贝类毒素等污染的双壳贝类脱除效果不佳。化学降解法虽能加速贝类体内污染物的排出，但净化后其化学残留物质可能对人体健康构成威胁。生物代谢净化技术凭借其天然、无毒、不易产生二次污染等优势，成为近年来的研究热点。除净化方法外，贝类净化效率还与多因素有关，如污染物种类及在贝体内存在形态、贝类种间差异、受污染程度和净化工艺条件等。

本课题组长期致力于活体贝类净化的相关研究，在香港牡蛎[3]、菲律宾蛤仔[4]、波纹巴非蛤[5]上均取得重要成效，但当前如何提高净化效率、缩短净化时间、减少净化过程损耗、降低净化成本、保障贝类食用安全性和高品质仍是产业关注焦点。基于此，文章拟从双壳贝类主要污染物及在活贝体内蓄积与转化规律、国内外贝类净化方法及其应用效果、影响贝类净化效果的关键因子等相关方面进行综述，分析活贝净化现存问题，展望贝类净化技术未来发展趋势，以期为贝类产业研究及从业人员提供理论参考。

1 贝类中污染物种类及富集、转化和清除规律

1.1 贝类中主要污染物

海洋污染物在整个食物链的主要传递媒介为双壳贝类，研究发现双壳贝类体内富集的污染物明显比其他种类生物要多[6]。为准确探究双壳贝类净化难易程度，表1 总结了影响贝类食用安全的污染物种类及来源。这些污染物以溶解、乳化及悬浮态等形式存在，贝类通过滤食将这些有毒有害污染物进一步蓄积及转化。

表1 贝类主要污染物及来源Table 1 Main pollutants of shellfish and its sources

1.2 贝类污染物蓄积、转化及清除规律

污染物在贝内蓄积能力决定了其净化的难易程度。由于双壳贝类滤食不具有选择性，因此污染物进入活贝体内通常有两种途径：一是通过腮呼吸作用直接吸收水体中溶解态的污染物，二是摄取食物中的微态污染颗粒进入消化系统随血液流通迅速分布到组织中[10]。贝类对污染物的富集能力受污染物种类、贝类品种、生理状态、暴露在污染环境中时间长短等因素的影响，通常活贝对污染物富集能力依次为致病性微生物、贝类毒素、HMs、POPs[11]。此外，由于组织功能的差异性，各组织对不同污染物的蓄积能力存在明显差异。主要表现为消化腺和腮是双壳贝类蓄积HMs 的主要靶器官。MARKICH 等[12]对贻贝（Mytilusedulis）不同组织中HMs 含量分析发现，各组织HMs 含量为消化腺>外套膜>闭壳肌>生殖腺>体液。内脏团及消化腺是蓄积贝类毒素最主要的部位，蓄积含量最高可占贝体内总毒素的90%以上[6]。LI 等[13]对扇贝（Patinopecten yessoensis）和蛤蜊（Saxidomus purpuratus）进行了毒素分析，发现毒素主要蓄积在消化系统中。此外，肠道及性腺是聚集致病性微生物的主要部位[14]。但污染物蓄积规律在不同贝类中存在例外，如奶油蛤（Saxidomus giganteus）将其毒素蓄积在含黑色素较多的出、入水管[15]。

污染物进入活贝体内后在特定条件下可发生相互转化，并对其生理代谢产生影响，一般来说，转化可分为体内生物转化与体外转化。SHIMADA 等[16]发现贝类毒素在生物体内转化过程中非极性与脂溶性的毒素会生成水溶性更强的代谢产物，经过生物降解排出体外，而少部分则通过代谢活化产生活性氧自由基（ROS），造成严重的氧化应激反应。但由于污染物类型、贝种类之间差异、代谢机理不同决定了其能否在短时间内脱除。长牡蛎（Crassostrea gigas）在暴露实验中能够快速将病原微生物清除到体外，具有清除速度快，清除率高等特点[17]。田华等[18]研究了栉孔扇贝（Chlamys farreri）、菲律宾蛤仔（Ruditapes philippinarum）、和竹蛏（Solen strictus）不同组织PSTs 的体外转化反应，发现PSTs 存在明显的组织及物种特异性。HMs 由于其具有较强的富集能力，因此，其较难通过体内转化将金属离子排出体外[12]。当活贝体内蓄积污染物及转化产物超出机体正常承载水平后，便会对机体防御系统造成损伤，导致贝体内DNA、脂类氧化损伤，细胞凋亡等一系列生物毒性效应，但生物体可通过调节自身抗氧化酶（SOD、MDA、CAT、GSH-Px）活力变化以减少危害提升净化效率[19]。因此，分析不同贝种、不同个体、不同组织对污染物富集、转化和代谢特征，对于选取适宜的净化方式具有重要的意义。

2 贝类净化方法及应用效果研究进展

为了有效脱除双壳贝类体内致病性微生物、HMs 和化学污染物，贝类净化技术的研究已成为行业热点。目前，双壳贝类净化技术主要分为灭菌海水暂养法、物理净化法、化学净化法、生物学净化法。

2.1 灭菌海水暂养法

灭菌海水暂养法是贝类净化中最常用的方法，即采用紫外（UV）、臭氧（O3）、氯及氯化合物等方法对海水减菌处理，利用贝类体内自身代谢活动，将受到污染的贝类置于无菌海水中暂养净化。表2 是不同海水减菌处理方法主要作用机理与优缺点比较。紫外线是贝类净化中最广谱、经济的方法，其对贝体内大肠菌群、副溶血性弧菌和霍乱弧菌等致病菌有较好的净化效果。ANDRITSOS 等[20]采用紫外净化系统（SDS）对循环海水灭菌，用于贻贝（Mytilus galloprovincialis）暂养净化，结果显示，净化24 h 后贻贝体内大肠菌群数量显著降低，净化率可达99%，然而该方法对病毒的脱除效果并不理想。大量研究表明，二氧化氯在净化活贝体内细菌和病毒具有良好的效果，POLO 等[21]研究证明，海水中二氧化氯浓度为2 ppm 时，能加速蛤蜊（Venerupis pullastra）和贻贝体内NOV 和HAV 的清除。但海水中氯浓度对净化效果至关重要，浓度过高易导致贝类死亡，且残留氯对生食贝类风味和口感产生较大影响。此外，臭氧具有弥散性、强氧化性等特点能有效杀灭活贝体内致病菌和病毒。AMOROSO 等[22]的研究表明，当海水中臭氧浓度达5 mg/L，净化48 h 能够脱除贻贝体内89%病毒。然而，臭氧稳定性较差，易受到温度、盐度、海水洁净程度的影响，从而削弱了灭菌效果，此外，海水中臭氧浓度高于0.5 mg/L 对贝类产生毒性作用[23]。

表2 不同方法对海水减菌处理主要作用机理与优缺点比较Table 2 Comparison of main action mechanism and advantages and disadvantages of different seawater sterilization treatment methods

采用传统或单一灭菌方式存在净化效率低，耗时长等问题，因此，可采用组合方式来增强净化效果，如：紫外线-臭氧[22]、紫外线-二氧化氯[21]能提高净化效率。近年来，由稀氯化钠或盐酸溶液制备的酸性电解水（pH5.0~6.5）应用于贝类暂养净化阶段可有效提高净化效率，如李国威等[24]采用微酸电解水（SEAW）净化虾夷扇贝（Patinopecten yessoensis）时发现，随着净化处理时间延长，净化8 min 扇贝表面及水体中弧菌由>1100 降至28 MPN/g。此外，采用酸性电解水（pH3.1；ORP 1150 mV；ACC 10 mg/L）净化菲律宾蛤仔（Venerupis philippinarum）和紫贻贝（Mytilus edulis），其体内菌落总数显著降低且保证存活率[25]。总体来说, 采用灭菌海水暂养净化法可在一定程度上脱除贝体内微生物、病毒且效率高，但对于受到HMs、贝类毒素、POPs 污染的贝类影响不大，且采用该方法长时间净化容易造成贝类营养、风味成分损耗。因此，对于受到轻度污染的贝类可采用该净化方法，但难以大规模应用于受深度污染的双壳贝类净化中。

2.2 物理净化法

物理净化法是一种不改变污染物化学形态，利用吸附、过滤、沉淀、曝气等原理，直接将贝类生理代谢产生大量悬浮颗粒、HMs 等污染物从水中去除的方法。贝壳[30]、活性炭[31]、沸石[32]、黏土[33]等均可用于双壳贝类净化的吸附剂。FIORATI 等[34]研究发现，纤维素基纳米海绵可高效吸附海水中的Cd、Cr、Cu 等离子，且不影响贝活力。王浩等[30]采用牡蛎壳、沸石、活性炭吸附材料对牡蛎进行净化，得出三种吸附材料脱除牡蛎体内HMs 效果为活性炭>牡蛎壳>沸石。吸附材料特性对净化效果有着密切的影响。QIU 等[31]比较了8 种不同粒径的活性炭对受到PSTs 污染贻贝进行吸附，发现净化1 d 和3 d 后贻贝体内PSTs 分别降低了41%和68%。此外，有研究指出沸石对致病性微生物吸附效果较为显著。GDOURA 等[32]采用天然沸石材料对蛤蜊（Ruditapes decussatus）净化24 h，发现大肠菌群含量由最初的18000 降至53 MPN/g，沙门氏杆菌也降至最低检测值。由于改性黏土（MC）具有良好的吸附性和膨胀性，近年来已广泛应用于双壳贝类净化中。LI 等[33]发现MC 的应用可以有效地防止双壳类摄入有毒藻类细胞，并通过沉淀沉积物中的有毒藻类细胞来减少毒素的积累，且沉积物中毒素更易脱除。此外，废弃贝壳、稻壳、食物果皮、蛇纹石等均具有较强的吸附能力，将这些固态废物经过处理也可成为新型吸附材料[35]。

近年来，新型冷杀菌技术，如：高压静水技术、辐照技术、高密度CO2等，在水产品储藏与保鲜加工中研究的非常多，它能高效杀灭病原微生物、病毒和寄生虫，且较好地保存水产品原有的口感风味，但应用于活体双壳贝类暂养净化阶段还未见报道[36]。总的来说，物理净化法具有吸附容量大、可循环利用等优点，但耗时长，容易造成二次污染，难以去除溶解性有机物，因此，如何将传统物理净化法与新型冷杀菌技术相结合应用于活体贝类暂养净化中是未来应该深入研究探讨的问题。

2.3 化学净化法

化学净化法是在净化用水中加入化学试剂，让贝类摄食后能起到吸附或拮抗污染物，从而生成一系列的反应，以加快贝体内污染物的排出速度，是净化HMs 效果最为显著的方法。常见的净化试剂有乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、维生素C、壳聚糖及衍生物、金属硫蛋白（MTs）等（表3）。

表3 不同化学净化剂对双壳贝类重金属脱除效果Table 3 The removal effect of different purifiers on heavy metals in bivalves

FANG 等[44]实验表明，壳聚糖微粒（CMs）对牡蛎（Crassostrea virginica）净化过程中创伤弧菌去除效果显著，净化48 h 后其体内创伤性弧菌降至2.0 log CFU/g。类似地，XIE 等[45]研究指出，壳聚糖对牡蛎净化过程中PSTs 具有较好的脱除效果。研究发现净化过程中添加EDTA 钠盐不仅可以改良水质，且可降解贝体内HMs，BUDIAWAN 等[46]采用曝气灭菌水循环系统与净化过程中加入EDTA 相结合净化青贻贝（Perna viridis），发现Perna viridis组织中Hg、Pb 含量显著降低。但由于贝类代谢能力较差，对重金属敏感性低，导致其在体内蓄积量大，因此在净化过程中加入强氧化剂可加速重金属离子排出体外，李学鹏[47]将褶牡蛎（Alectryonella plicatulaGmelin）暴露在浓度为200 mg/L 维生素C 海水中，净化31 d，发现维生素C 可诱导HMs 排出，其体内Cu、Pb、Cd 的排出率分别为32.3%、64.8%和31.4%。

近年来，绿色、安全、高效的化学脱除剂的筛选、制备、利用成为研究新趋势。金属硫蛋白备受关注，它具有结合金属能力和高诱导特性的低分子量蛋白质，对Zn、Cd、Ca 等目标离子有非常强的亲和力。ZHANG 等[42]采用MTs 水解物（pH-Fe2+）对蓝贻贝净化，发现净化15 d 后，Cd 浓度从46.1 μg/g 降至23.3 μg/g。此外，在贝类水解液脱除HMs 工艺中也有非常多具有潜力的脱除剂，如：柠檬酸、琥珀酸、植酸、螯合树脂和离子交换型树脂等脱除剂在净化重金属方面效率高且用时短，但应用于活体双壳贝类暂养净化阶段还未见报道[48]。总体来说，采用化学法净化双壳贝类可在一定程度上脱除活体贝类体内的HMs、贝毒素及致病性微生物，但容易产生化学残留，在加入化学试剂的同时易对双壳贝类生理反应及代谢造成影响。因此，急需开发绿色、安全、高效的脱除剂以保证净化效果和品质。

2.4 生物学净化法

生物学净化法是指将有益微生物菌群混合，抑制有害菌繁殖，或通过食物链将具有可促进污染物排出的饵料投喂给受污染的贝类，以提高贝类代谢活力，达到减少生物体中污染物的目的。利用天然产物净化双壳贝类是生物净化法研究的新趋势。SHEN等[29]采用加入葡萄籽提取物（GSE）的紫外辐照人工海水（ASW）对太平洋牡蛎（Crassostrea gigas）进行净化，发现当ASW 中GSE 浓度在1.0%或1.5%时，副溶血性弧菌分别降低3.01 和4.18 log MPN/g。类似地，赵明明等[49]以葡萄牙牡蛎（Crassostrea angulata）为研究对象，在净化过程中加入大蒜素，净化12 和24 h 后，其体内大肠菌群含量由最初的2307 MPN/100 g 分别降至240 和189 MPN/100 g，达到生食标准。RONG 等[50]采用抗菌多肽用于牡蛎净化，发现净化36 h 后其体内副溶血性弧菌含量降低了2.35~2.76 log CFU/g。由于贝类滤食藻类不具有选择性，在暂养净化过程中投喂适宜饵料如：金藻、扁藻、小球藻及藻类孢子等能降低贝类在净化过程中营养成分损耗，且提高代谢活力加快贝体内污染物的排出速率。叶挺等[51]利用大型海藻龙须菜（Gracilaria lemaneiformis）净化葡萄牙牡蛎，发现净化14 d 后贝体内Cu、Cd、Pb 含量分别为1.93、0.58、0.33 mg/kg，均低于检测限值。

近年来，益生菌制剂在水产养殖中研究的非常多，如：枯草芽孢杆菌、酵母菌、乳酸菌等，它能净化水质、预防疾病、且绿色、安全。姚茹等[52]发现，在牡蛎养殖水体中加入微生态制剂及微藻，能降低水中NH3、NaNO2含量，同时可促进牡蛎体内蓄积HMs 排出。益生菌制剂在活贝净化中具有重要的研究价值和广阔的应用前景。总体来说，采用生物学净化法其成本低、适应范围广、具有生态性和再生性、不会造成二次污染，适合大批量工厂净化。

3 影响双壳贝类净化效果关键因子

贝类在净化过程中实际上是其自然滤食将体内污染物排出的过程，研究表明适宜的环境及生理条件能提升贝类的净化效率[53]。影响贝类净化的工艺条件与环境因子主要包括污染物种类、净化时间、净化方法、贝水比、净化系统设计、水质参数如：盐度、温度、pH 等。国内外关于双壳贝类净化条件的探索越来越多，部分双壳贝类最佳净化工艺条件如表4 所示。

表4 部分双壳贝类的最佳净化工艺条件Table 4 The best depuration process conditions for some bivalves

3.1 污染物因素

海洋污染物种类众多，理化性质不同，在贝类中积累分布组织也产生差异，对净化效果也产生了直接影响。大量研究表明，双壳贝类一旦受到重金属、贝类毒素、POPs 污染将很难在短时间内通过净化排除食用风险，能在短期内达到净化目的几类污染物中，净化难易程度依次为泥沙、致病性微生物、病毒。BRAGA 等[57]研究发现，采用紫外循环灭菌海水净化感染石房蛤毒素和PSTs 的紫贻贝，净化10 d 后其脱除率分别为23.4%和57.8%。祁剑飞等[54]采用流水式紫外线杀菌方法对葡萄牙牡蛎净化48 h，得出菌落总数和大肠菌群含量均大幅下降，但HMs、POPs 等指标基本无变化。此外，脱除效率还与污染物类型直接相关，研究人员在脱除贻贝体内HMs 时发现其含量递减顺序为Pb>Co>Cd>Cr>Cu>Mn>Ni>Zn>Fe[58]。因此，贝类净化需根据去除目标污染物，选择适宜的净化方法。

3.2 贝种间差异及受污染程度

不同贝类对污染物的蓄积敏感性存在明显差异，污染物能否被及时脱除也因受污染程度相关。LOVE 等[59]采用海水循环系统净化美洲牡蛎（Crassostrea virginica）和蛤蜊（Mercinaria mercinaria），发现不同物种之间对污染物脱除效率存在明显差异，净化5 d 后，美洲牡蛎体内污染物净化率从高到低依次为：MS2（phages）>大肠杆菌>粪肠球菌>脊髓灰质炎病毒>HAV，但蛤蜊则表现为：大肠杆菌>粪肠球菌>HAV>MS2（phages）>脊髓灰质炎病毒。牡蛎和贻贝等物种能在短时间内降解贝类毒素，而在重金属方面牡蛎则表现出强吸附性的特点，TAKATA 等[60]发现，牡蛎在循环式海水中净化48 h，其体内PSTs 降低了68%。邴晓菲等[61]研究指出，栉孔扇贝对PSTs呈现出迅速蓄积和缓慢代谢的特点。此外，贝类原生环境及沉积物中污染物浓度对贝类污染程度产生直接的影响。WANG 等[62]对中国胶州湾地区菲律宾蛤仔体内HMs 含量分析，发现菲律宾蛤仔组织内Cd、Zn 和Cr 含量与栖息沉积物中的含量显著相关。总体而言，需净化贝类所受污染程度越小，净化时间及成本也就越低。

3.3 净化过程水质参数

净化过程水质参数，如水温、盐度、pH、溶解氧、氨氮等对活贝张壳、滤水等生理活动有重要影响，从而直接影响双壳贝类体内污染物的排出。温度是净化过程中水质条件的关键影响因子，研究表明，适当提升水温能减缓贝类应激反应，降低净化过程死亡率及提升净化效果[63]。POMMEPUY 等[64]发现，温度＜16 ℃，净化7~11 d 长牡蛎体内病毒降低1 个对数值，当海水温度>20 ℃，净化3~4 d 即可下降1 个对数值。PHUVASATE 等[65]发现水温在7~15 ℃条件下，净化5 d，太平洋牡蛎体内副溶血弧菌低于3 log MPN/g，且存活率最高。类似地，FARRELL等[66]研究指出，提升海水温度也能加速牡蛎中PSTs 蓄积及代谢。盐度影响贝类的渗透压，从而改变其滤水率，盐度高低直接影响贝类的代谢速率。在采用紫外循环灭菌海水净化太平洋牡蛎体内副溶血性弧菌时发现，海水盐度为20‰~30‰条件下优于10‰[67]。JAHROMI等[68]发现，牡蛎在20‰低盐度条件下净化效果最差，而珍珠贝（Pinctada martensii）则耐受多种盐度（20‰~40‰）。因此，净化需与贝类源生长环境条件紧密结合，根据要去除的目标污染物，在净化过程中选择适宜净化条件，以达到高效净化的目的。

3.4 净化工艺条件

净化工艺设计条件不合理，容易对贝类造成二次污染。包括贝水比、水流量、净化池排污能力、净化层数等。林清等[28]采用紫外臭氧组合净化近江牡蛎，分别设置不同贝水比1:5、1:10、1:15，得出随着贝水比增加，各个试验组的大肠菌群及菌落总数呈下降趋势。慕翠敏[17]研究不同工艺条件对太平洋牡蛎大肠杆菌消除影响，发现贝水比1:6，水交换率3 次/h，净化层数为上层时，净化效果最佳。此外，水流速度决定了净化池的排污效率，近江牡蛎在净化过程中,当水交换率4 次/h 时，体内大肠菌群由13.4 降至3 MPN/g，净化效果优于2 次/h 和8 次/h[28]，水流量的选择应综合考虑污物的排出和水体的净化。

4 总结与展望

双壳贝类中，海洋污染物超标已成为阻碍贝类产业发展的主要障碍，因此，及时掌握海洋环境及贝类污染状况，研究污染物在贝体内蓄积及转化规律，科学、有针对性地运用不同净化活贝方法具有重要意义。但我国作为双壳贝类产量大国，因净化成本高，技术相对薄弱，虽经过净化工序流程，但质量稳定性差，常在保活流通过程中易滋生病原菌造成卫生安全隐患。要实现贝类净化技术产业化，取得国际市场认可，需在以下方面继续深入研究：a.加强养殖海域卫生管理，从源头解决双壳贝类污染问题。b.建立健全双壳贝类净化卫生指标，与欧美发达国家卫生指标达到相同水平，建立生食贝类卫生标准，及时更新净化过程中的技术指导规范，以便为中小型企业提供参考。c.加强冷杀菌技术及益生菌制剂在活体贝类净化中的应用研究，开发新型绿色、高效安全的化学净化剂，同时将灭菌海水暂养净化、物理吸附法、化学降解法、生物代谢等多种净化方式有机结合，提高净化效率。d.加强净化设备研发力度，运用现代化传感、自动化、智能化技术搭建一体的贝类净化实时动态监测系统，实现对贝类净化全智能监测与精细化管理。e.深入研究净化过程中贝类能量代谢问题，降低净化造成贝类的主要营养成分损耗，风味品质的变化。f.深入研究阐明污染物在双壳贝类体内蓄积、转化、代谢机制，为保障水产品安全及贝类养殖加工产业发展提供科学支撑。在上述问题不断完善的基础上，双壳贝类净化技术将有广阔的应用前景。