莲原花青素对华夫饼AGEs 的抑制及感官品质的影响

谈江莹，陈紫婷，秦佳斌，王伊琳，吴 茜

（湖北工业大学生物工程与食品学院，湖北武汉 430068）

食品加工中发生美拉德反应所形成的潜在危害安全物质如丙烯酰胺（acrylamide, AA）、杂环胺（heterocyclic amines, HAs）和晚期糖化终末产物（advanced glycation end products, AGEs）等[1]已受到广泛关注。AGEs 是经过美拉德反应中期、后期阶段形成的一类复杂化合物的总称，其形成和积累与衰老和糖尿病等多种疾病的发病机制有关。如AGEs与糖化终产物受体结合，诱导机体发生氧化应激与炎症反应[2]；KATARÍNA 等[3]已发现，过多地摄入热加工的食品会导致糖尿病，并诱发炎症，增强氧化应激，促进动脉粥样硬化的发生。此外，一系列的动物研究发现，老鼠食用富含AGEs 的食物会引起尿蛋白增加[4]和肾脏损伤等一系列问题。这些发现表明，饮食中AGEs 可能被认为是威胁人类健康的慢性危险因素。因此，有必要了解食物中饮食AGEs 的情况。

调控烘焙食品中美拉德反应产物AGEs 的传统方法非常依赖于产品及加工参数（如温度）、成分（如前体含量、pH 和含水量）等，这些因素的变化或抑制剂的添加都会影响食品的质量[5]。然而，近几年发现一种潜在的治疗方法，通过使用各种天然抗氧化剂，清除美拉德反应中形成AGEs 的自由基，达到抑制AGEs 生成的目的。目前发现可用于食品加工的AGEs抑制剂主要包括黄酮类、酚酸等多酚类物质[6]。许多酚类化合物在模拟生理条件下具有抗糖化作用，如莲原花青素（LSPC）。莲原花青素是从莲科植物莲的成熟花托中分离的天然多酚类化合物，主要由（+）-儿茶素、（−）-表儿茶素和B 型原花青素二聚体、三聚体、四聚体组成[7]。LSPC 是国际公认的最有效的天然抗氧化剂，分子结构中的多元羟基赋予莲原花青素优良的抗氧化活性和与酶的结合能力[8]，并使其在体内发挥降血糖[9]、抗肿瘤[10]、抗炎[11]、抗衰老[12]、预防心血管疾病[13]和抑制AGEs 的生成[14]的作用。

迄今为止，很少有研究全面评价酚类化合物与AGEs 之间的抑制关系及感官品质的影响。华夫饼作为一种热加工食品，其中含有大量的糖类、蛋白质及脂类，在热加工过程中会发生剧烈的美拉德反应从而生成AGEs。因此，本研究以添加不同LSPC 浓度的华夫饼为研究对象，探究LSPC 对华夫饼中AGEs 抑制和感官品质的影响，为深入研究LSPC 对食品热加工过程中AGEs 抑制作用及感官品质影响提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

莲原花青素粗提物 华中农业大学食品科技学院天然产物实验室提供，经AB-8 大孔吸附树脂进一步纯化后，以葡萄籽原花青素为对照，采用盐酸-正丁醇法测得其原花青素含量为98.87%（w/w）；面粉、白砂糖、黄油、玉米淀粉 安琪酵母股份有限公司；鸡蛋 正大集团；德亚全脂纯牛奶 品渥食品股份有限公司；甲醇 色谱纯，瑞典Oceanpak 试剂公司；甲酸 色谱纯，阿拉丁试剂（上海）有限公司；其他试剂均为分析纯或色谱纯，均来自上海麦克林生化科技有限公司。

ME3002/02 电子天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；CT15RE 离心机、F7000 荧光酶标仪 日本日立公司；XW-80A 微型涡旋混合仪 上海泸西分析仪器厂有限公司；UV-1601 紫外可分光光度计 北京瑞丽分析仪器有限公司；RF5301 荧光分光光度计 日本岛津公司；HH-8CJ 数显恒温磁力搅拌水浴锅 常州市金坛友联仪器研究所；FE20 型pH 计 瑞士Mettler-Toledo；RE-111 旋转蒸发仪瑞士Buchi 公司；1260 型高效液相质谱联用仪 美国安捷伦科技有限公司；LSPCX 固体萃取柱、Eclipse Plus C18色谱柱 Agela 科技公司；PEN3 便携式电子鼻系统 德国Airsense 公司；7890A/5975C气相色谱质谱联用仪 美国安捷伦公司；SPME 手动进样萃取头 美国Supelco 公司；TA-XY2i 型质构仪 美国Stable Micro System 有限公司；CM3500d反射分光光度计 日本大阪的柯尼卡美能达传感公司。

1.2 实验方法

1.2.1 华夫饼的制备 根据杨军等[15]的方法略有改动。所有华夫饼都用相同的原料制备。首先，分离两个鸡蛋的蛋清蛋黄，在蛋黄中加入65 g 面粉，40 g 黄油，90 mL 牛奶，5 g 玉米淀粉后混合成蛋黄浆液；在蛋清中分三次加入25 g 白砂糖，搅拌至硬性发泡。将搅拌好的蛋白霜分两次加入蛋黄浆液，以切拌方式搅拌均匀，在模具中分别倒入20 g 华夫饼浆液。按表1 分别将不同浓度LSPC 溶于1.5 mL 去离子水中搅拌均匀。然后将样品在170 ℃下烘焙20 min。

表1 LSPC 添加量Table 1 Content of LSPC

1.2.2 荧光AGEs 抑制率的测定 根据ZHANG 等[16]的方法略有改动，用去离子水提取模型华夫饼（250 mg），并用4.75 mL Carrez 溶液澄清（吐温−20，0.05% v/v；SDS，1% w/v；β-巯基乙醇，5% v/v；Tris-HCl，50 mmol/L，pH7.4），超声（300 W，37 ℃，30 min），离心（3000 r/min，10 min，25 ℃）并过滤（100 μL）。使用酶标仪在355/405 nm 的激发/发射波长下测定荧光AGEs。不包含LSPC 的反应溶液用作对照组。抑制率的计算公式为：

式中，F对照表示对照组荧光AGEs 强度，F样品表示样品组荧光AGEs 强度。

1.2.3 羧甲基赖氨酸含量（Nε-（Carboxymethyl）lysine，CML）的测定

1.2.3.1 样品处理 根据GENGJU 等[17]的方法略有改动。在4 ℃下，将2 mL 0.2 mol/L 硼氢化钠（pH13~14）添加到模型华夫饼样品（500 mg）中12 h。使用4 mL 氯仿/甲醇（2:1，v/v）溶液对反应溶液进行脱脂，然后离心（在−4 ℃下15000 r/min）1 h。随后，将盐酸混合至终浓度为6 mol/L，并将样品在110 ℃下水解24 h。将最终的CML 萃取液浓缩，直到用旋转蒸发仪干燥，然后溶解在4 mL 硼酸钠缓冲液（0.2 mol/L，pH9.4）中，然后进行最终的膜过滤（尼龙，0.45 mL）。根据SUN 等[18]的方法，对CML 处理测量方法进行了适当修改，将样品（15 μL）注入Eclipse Plus C18色谱柱。

1.2.3.2 液相条件 流动相A：含0.2%甲酸的水溶液。流动相B：纯甲醇，流速0.2 mL/min。梯度洗脱条件为0~0.5 min 10%B，0.5~4.0 min 10%~60%B。特征离子碎片m/z 84 和m/z 130 处的片段用于定性CML（m/z 205）。用CML 标准品外标曲线对样品中CML 含量定量。通过MassHunter Data 和MassHunter Qualitative 对数据进行分析。

1.2.3.3 CML 抑制率计算 CML 的标准曲线方程为：y=2×106x+56683，R2=0.9928。

式中，x 表示CML 浓度，μg/mL；y 表示CML 的峰面积。

式中，X样品表示LSPC-1、LSPC-2、LSPC-3、LSPC-4 样品组CML 浓度，μg/mL；X对照表示LSPC-0 样品组CML 浓度，μg/mL。

1.2.4 总酚含量的测定 参照LI 等[19]的方法略有改动，提取华夫饼中总酚。样品溶于50%乙醇溶液（1:1，v/v），超声溶解（37 ℃，1 h），离心（25 ℃，3000 r/min，5 min），分离固液相，保留上清液，取样液（1.5 mL）与福林酚试剂（1.5 mL）混合静置3 min，再加入碳酸钠溶液（15%，1 mL），静置30 min，离心后（25 ℃，3500 r/min，3 min），收集上清液，以15%碳酸钠溶液为空白，测定760 nm 处的吸光度。标准曲线：y=0.0336x+0.0901，R2=0.9288。

式中，x 表示总酚含量（mg），y 表示760 nm 下测得的吸光值。

1.2.5 正丁醇-盐酸法测定莲原花青素消耗率 将华夫饼粉末（500 mg）与25 mL 甲醇混合，超声处理（37 ℃，30 min），离心后（3000 r/min，5 min，25 ℃）过滤（1 mL）。取上清液，将其转移至带塞子的10 mL试管中，依次添加0.2 mL 硫酸铁铵溶液和6 mL 正丁醇-盐酸溶液，并充分摇匀。将反应溶液在95~97 ℃的水浴中浓缩回流40 min 后，迅速用冷水冷却，并在546 nm 波长处测量吸光度。基于吸光度和浓度之间的关系绘制标准曲线，以计算残留的LSPC的量。用甲醇代替样品作为空白对照。消耗率的计算公式为：

式中，F对照表示对照组LSPC 含量（mg），F样品表示样品组LSPC 含量（mg）。

1.2.6 抗氧化活性测定

1.2.6.1 DPPH 自由基清除率 根据SING 等[20]的方法略有修改，估算了每种华夫饼提取物的DPPH自由基清除能力。将华夫饼粉末（200 mg）与10 mL去离子水混合，超声处理（37 ℃，60 min），离心（3000 r/min，5 min，25 ℃）并过滤（1 mL）。在试管中将酚提取物样品（0.2 mL）或0.2 mL 去离子水（空白）与3.8 mL 0.1 mmol/L DPPH-乙醇溶液混合。将DPPH-乙醇溶液替换为乙醇溶液作为对照或调零。将样品在室温下黑暗中静置2 h 后在517 nm 下测量吸光度。

式中，A样品表示样品组吸光值，A对照表示对照组吸光值，A空白表示空白组吸光值。

1.2.6.2 ABTS 自由基清除率 根据THAIPONG 等[21]的方法略有修改。将华夫饼粉末（200 mg）与10 mL去离子水混合，超声（37 ℃，60 min），离心（3000 r/min，5 min，25 ℃）并过滤。储备溶液包括2.6 mmol/L 过硫酸钾溶液和7.4 mmol/L ABTS 溶液。然后通过将两种储备溶液等量混合并在室温下于黑暗中反应12 h 来制备工作溶液。通过使用分光光度计将21 mL去离子水与1 mL ABTS+溶液混合来稀释溶液，以在734 nm 处获得0.70±0.02 单位的吸光度。每次测定前制备新鲜的ABTS+溶液。使酚提取物（100 μL）与400 μL 的ABTS+溶液反应。用乙醇溶液代替酚提取物样品作为空白。然后使用酶标仪在734 nm处测定吸光度。

式中，A样品表示样品组吸光值，A空白表示空白组吸光值。

1.2.6.3 FRAP 铁离子还原能力 使用ERDOGANORHAN 等[22]的方法略有修改测试了还原铁的能力。将华夫饼粉末（200 mg）与10 mL 去离子水混合，超声（37 ℃，60 min），离心（3000 r/min，5 min，25 ℃）并过滤（1 mL）。在试管中将酚提取物样品（100 μL）与300 μL 去离子水混合。然后加入3 mL 工作液（100 mL 乙酸钠缓冲液，10 mL 10 mmol/L TPTZ溶液和10 mL 20 mmol/L FeCl3溶液）。用去离子水代替工作液作为对照。用去离子水代替酚提取物样品作为空白。剧烈摇动混合物后，将样品在37 ℃水浴锅中加热4 min。将200 μL 反应溶液加入到酶标仪中，并在593 nm 处测量吸光度。

式中，A样品表示样品组吸光值，A对照表示对照组吸光值，A空白表示空白组吸光值。

1.2.6.4 羟自由基清除率 根据LI 等[23]的方法略有修改，对每种华夫饼提取物的羟自由基清除能力进行了估算。将模型华夫饼（200 mg）与10 mL 去离子水混合，超声（37 ℃，60 min），离心（3000 r/min，5 min，25 ℃）并过滤（2 mL）。在试管中将酚提取物样品（1.5 mL）或1.5 mL 去离子水（空白）与1.5 mL 9 mmol/L水杨酸-乙醇溶液混合。然后，加入1.5 mL H2O2（8.8 mmol/L）和1.5 mL FeSO4（9 mmol/L）。用去离子水代替FeSO4溶液作为对照。去离子水用于调零。充分混合后，将样品在37 ℃的水浴箱中加热10 min。将200 μL 反应溶液加入到酶标仪中，并在510 nm处测量吸光度。

式中，A样品表示样品组吸光值，A对照表示对照组吸光值，A空白表示空白组吸光值。

1.2.7 水分的测定

1.2.7.1 水分含量的测定 使用水分含量仪（200 mg，105 ℃）测定样品的水分含量。

1.2.7.2 水分活度的测定 使用便携式水分活度仪在25 ℃下测定水分活度。

1.2.7.3 低场核磁的测定 根据CAO 等[24]描述的方法稍作调整进行 NMR 测量。将样品放入15 mm×200 mm 的核磁管中，并置于LF-NMR 分析仪中。该测试是在100 kHz 的谐振频率下进行的。横向（T2）弛豫是通过Carr-Purcell-Meiboom-Gill 脉冲序列获得的，该序列具有4 个扫描和12000 个回波。两次连续扫描之间的重复时间为3 s，脉冲之间的τ 值为250 μs，分别为90°和180°。T2 分布是通过MultiExp Inv 分析软件获得的。整个过程在20 ℃下进行三次重复。

1.2.8 pH 测定 将华夫饼粉末（250 mg）与25 mL水混合并涡旋3 min。将混合物在室温下保持1 h 以分离固相和液相。小心除去上清液层后，使用pH 计测定pH。

1.2.9 华夫饼质构分析 根据王丽莎等[25]的方法稍加改动，测量华夫饼质构。采用纹理分析仪的P/36R圆柱探头，按样品标记顺序进行测量。测量前探针离样品越近越好。压缩实验参数设置如下：工作模式为TPA 方案；探针诱导5 g；测量前后中速度为5 mm/s；目标模式应变为50%；数据采集点为500 pps，记录硬度、弹性、凝聚力、胶粘性、咀嚼性和回弹性等纹理参数。

1.2.10 色度测定 根据谷满屯等[26]的方法稍加改进测量华夫饼色度。华夫饼的颜色用CM-3500d 反射分光光度计进行测量，结果用CIE Lab 色彩系统表示。在华夫饼表面的不同区域对a*（红色），b*（黄色）和L*（亮度）参数进行了三个独立的测量。根据等式计算E值。用标准校准白板CRA43（L*=93.80；a*=0.3156；b*=0.3319）校准设备。

1.2.11 电子鼻分析 根据贾洪锋等[27]的方法稍作调整，测量华夫饼电子鼻。称量1 g 华夫饼粉末，将其放入20 mL 样品瓶中，添加适量10%生理盐水以完全润湿样品，密封样品瓶，在37 ℃水浴中加热30 min。使用PEN3 电子鼻进行风味检测。电子鼻测试条件：样品测试时间200 s，采样间隔1 s，清洁时间120 s，复位时间10 s，内部流速300 mL/min，样品流速300 mL/min。对所有样品重复测量3 次。使用PEN3 电子鼻头随附的数据处理软件对数据执行主成分分析。

1.2.12 华夫饼挥发性成分GC-MS 测定

1.2.12.1 样品预处理 根据LU 等[28]的方法稍加改进测量华夫饼气质。称量1 g 华夫饼粉末到20 mL顶空微萃取样品瓶中，放入转子中，添加1 g 氯化钠粉末以促进风味成分挥发，盖上盖子，插入萃取头以固定。在磁力搅拌下于60 ℃的恒温水浴中平衡30 min 后，向下推光纤头继续萃取10 min，清理光纤头，拔下萃取头的插头，然后插入气相色谱仪的入口。

1.2.12.2 GC 条 件 HP-5MS 毛 细 管 柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；载气（He）流速1.0 mL/min；不分流进样；入口温度250 ℃；升温程序：柱初始温度在40 ℃保持2 min，以4 ℃/min 升至160 ℃，保持1 min，然后以10 ℃/min 升至250 ℃，保持5 min。

1.2.12.3 MS 条件 电子电离源；电子能量70 eV；离子源温度230 ℃；GC-MS 界面温度280 ℃；四极温度150 ℃；质量扫描范围m/z 30~550。

1.3 数据处理

运用IBM SPSS Statistics 21 软件对数据进行统计分析，结果以±s 表示，通过一元方差分析（One-Way ANOVA）进行多个组间平均数的比较，如果组间存在显著性差异（P＜0.05），则采用Duncan 检验进行组间多重比较。利用Origin 8.0 软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 莲原花青素对华夫饼荧光AGEs 抑制率和CML抑制率的影响

目前已发现的AGEs 有20 种，依据荧光特性可分为荧光AGEs 和非荧光AGEs，其中，CML 是非荧光AGEs 的重要代表[29]。一方面CML 能与蛋白质产生交联，进而改变一些基质蛋白分子的正常功能，另一方面，CML 还能与特异受体结合，通过生理反应来改变蛋白质和细胞功能，从而导致机体的病理变化[30]。由图1a 二级质谱图所示，84 m/z 的主离子碎片可以确定LSPC-3 华夫饼样品中存在确定CML，由图1b 提取离子流色谱图所示，可以定量LSPC-3 华夫饼样品中CML 峰面积，从而计算CML 含量。

图1 LSPC-3 华夫饼的二级质谱图和提取离子流色谱图Fig.1 Secondary mass spectrometry and extract ion chromatograpy of LSPC-3 waffle

如图2 所示，添加不同浓度LSPC 华夫饼中，荧光AGEs 抑制率和CML 抑制率都随LSPC 浓度的增加而呈上升趋势，呈现剂量依赖性（荧光AGEs 抑制率的R2=0.993，CML 抑制率的R2=0.997）且有显著性影响（P＜0.05）。其中，LSPC-4 样品的荧光AGEs抑制率和CML 抑制率最高，分别为（40.53%±1.43%）、（72.08%±0.79%）。这表明随华夫饼中LSPC 浓度的增加，LSPC 与华夫饼中蛋白质、糖类等发生作用，因此，美拉德反应物一定程度上有所减少，生成的荧光AGEs 含量和CML 含量都相应减少，荧光AGEs 抑制率和CML 抑制率增高。同时，LSPC 作为天然抗氧化剂具有抗氧化作用，可以有效抑制美拉德反应中的氧化反应，从而抑制美拉德反应中有害AGEs 的生成。由此可见，在一定浓度范围内，LSPC 浓度越高，其对荧光AGEs 和CML 抑制作用越强，在食品中添加一定浓度的LSPC 可以有效抑制AGEs 的生成。

图2 不同浓度LSPC 对华夫饼中AGEs 及CML 的抑制率的影响Fig.2 Effects of different concentrations of LSPC on inhibition rate of AGEs and CML in waffles注：不同小写字母代表AGEs 抑制率差异显著（P＜0.05）；不同大写字母表示CML 抑制率差异显著（P＜0.05）。

2.2 莲原花青素对华夫饼总酚含量的影响

LSPC 是植物中广泛存在的一大类多酚类化合物的总称[31]。如图3 所示，添加不同浓度LSPC 华夫饼的总酚含量范围为9.21~13.23 mg/g。在没有添加LSPC 的LSPC-0 样品中仍含有总酚，即华夫饼其本身含有某些种类的酚类物质。在加入4.0 mg/g 的LSPC 后，总酚含量出现显著性增加（P＜0.05）。总酚含量的增加主要是剩余LSPC 的量，尽管LSPC 绝大部分被消耗，但是存在一定的剩余。

图3 不同浓度LSPC 对华夫饼中总酚含量的影响Fig.3 Effects of different concentrations of LSPC on total phenol content in waffles注：不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）；图4、图8 同。

2.3 莲原花青素对华夫饼莲原花青素消耗率的影响

如图4 所示，添加不同浓度LSPC 华夫饼中，LSPC 消耗率随LSPC 浓度增加而呈上升趋势，呈现剂量依赖性（R2=0.998）且有显著影响（P＜0.05）。其中，LSPC-4 样品的消耗率为（88.82%±0.05%），表现最高。结合图2 结论：LSPC 浓度增加，其对美拉德反应产物AGEs 和CML 的抑制效果增强，推测随LSPC 浓度的增加，与美拉德反应物作用的LSPC和抑制美拉德反应中氧化反应的LSPC 逐渐增加，因此，抑制美拉德反应产物AGEs 和CML 生成的能力越强。但同时温度对LSPC 影响较大，随加热时间的延长，LSPC 含量在不同程度上有所降低[32]。因此，LSPC 消耗的原因既可能是由于抑制美拉德反应消耗，也可能是由于加热过程中自身消耗或与其它组分相互作用。

图4 不同浓度LSPC 对华夫饼中LSPC 消耗率的影响Fig.4 Effect of different concentrations of LSPC on consumption ratio of LSPC in waffles

2.4 莲原花青素对华夫饼抗氧化活性的影响

糖化过程易产生AGEs，而自由基及氧化应激能加速糖基化的进程，因此，研究LSPC 对华夫饼中DPPH 自由基清除能力、ABTS 自由基清除能力、FRAP 铁离子还原能力以及羟自由基清除能力的影响。

如图5 所示，在添加一定浓度范围的LSPC 华夫饼中，DPPH 自由基清除能力、ABTS 自由基清除能力、FRAP 铁离子还原能力以及羟自由基清除能力基本呈上升趋势。其中，最显著的是DPPH 自由基清除能力，随LSPC 浓度增加，其显著增加（P＜0.05）。添加LSPC 后华夫饼的FRAP 铁离子还原能力以及羟自由基清除能力与未添加LSPC 的华夫饼相比也有显著差异（P＜0.05）。

图5 不同浓度LSPC 对华夫饼中抗氧化性的影响Fig.5 Effects of different concentrations of LSPC on antioxidant properties in waffles注：HRSA 指羟自由基清除率；不同小写字母表示组间（同一抗氧化指标）差异显著（P＜0.05）。

综上，抗氧化能力最强的为LSPC-4 样品组，其总酚含量对应也是最高的。这表明，总酚含量与抗氧化能力存在一定的关系且在本实验研究呈现出正相关[33]。这也与其它研究结果一致：样品中的DPPH 自由基的清除率与多酚含量呈正相关关系，而且关系极显著。尽管多酚类物质可能与蛋白质消化产生肽相互作用，但仍具有较高的清除自由基的能力[34]。因此，多酚物质的存在在一定程度上有利于提高华夫饼的抗氧化能力。

同时，抗氧化能力直接影响美拉德反应中的氧化反应。在实验浓度范围内，LSPC 浓度越高，其抗氧化能力越强，从而抑制美拉德反应中氧化反应能力越强，抑制AGEs 生成的能力越强，即AGEs 抑制率越高，与上述实验结论也相符。因此，可推测LSPC抑制AGEs 生成的部分机理可能与酚类物质的抗氧化活性提高食品的抗氧化性有关。

2.5 莲原花青素对华夫饼水分变化的影响

美拉德反应是生成AGEs 的重要途径，而水分含量、水分活度以及水分存在形式都有可能影响到美拉德反应。因而，研究LSPC 的加入对华夫饼体系中水分含量、水分活度以及水分存在形式的影响。

如图6 所示，添加不同浓度LSPC 后各华夫饼样品组的水分活度无显著差异（P>0.05）。这表明在实验浓度范围中，LSPC 不影响华夫饼中水分活度。其次，添加高浓度LSPC 的华夫饼样品LSPC-3和LSPC-4，相较于未添加LSPC 或添加低浓度LSPC 的华夫饼，其水分含量有显著性下降（P＜0.05）。由此推测，添加LSPC 后，水更易与小分子多酚类物质结合，从而降低水分含量[35]。

图6 不同浓度LSPC 对华夫饼中水分含量及水分活度的影响Fig.6 Effects of different concentrations of LSPC on water content and water activity in waffles注：不同小写字母代表水分含量差异显著（P＜0.05）；不同大写字母表示水分活度差异显著（P＜0.05）。

由NMR 原理可知，质子所处的化学环境不同，其弛豫时间T2的长短便不相同，水分的自由度也不同[36−37]。弛豫时间T2越短表明水与物质结合越紧密，说明质子自由度越低，越难排出；弛豫时间T2越长说明质子自由度越高，越容易排出，因此，弛豫时间T2可以间接反映水分的相态特征[38−39]。不同弛豫时间T2波峰所覆盖的信号幅值，即弛豫时间T2区间的积分面积可表示各个区间氢质子的相对含量，实现对不同相态水分的定量测定。弛豫时间T2的变化能够反映水分子的流动性，因此可以了解添加不同含量LSPC 华夫饼中水分的迁移规律。

如图7 所示，华夫饼的T2图谱中包含多个峰，即说明华夫饼内部含有多组分水，其中，0.1~10 ms区间内的峰表示华夫饼中流动性最差的结合水，10~100 ms 区间内的峰表示华夫饼中的不易流动水，而100~1000 ms 范围内的峰表示华夫饼中可以自由流动的自由水[40]。而且，不易流动水对应的信号增幅最大，在实验浓度范围，其随LSPC 浓度增加逐渐下降。这表明，在实验浓度范围内，不易流动水含量随LSPC 浓度增大而减少，这与图6 所示高浓度LSPC华夫饼中水分含量有所下降相吻合。

图7 不同浓度LSPC 对华夫饼弛豫时间的影响Fig.7 Effects of different concentrations of LSPC on low field NMR in waffles

由上述结果可知，添加LSPC 对华夫饼中水分活度并无影响，但华夫饼中不易流动水含量有所减少，同时水分含量也相应减少。推测LSPC 可能通过影响华夫饼中水分的分布和迁移来影响水分含量，从而影响美拉德反应过程以抑制AGEs 的生成。

2.6 莲原花青素对华夫饼pH 的影响

pH 是美拉德反应中的重要影响因素。如图8所示，添加不同浓度LSPC 的华夫饼中，其pH 无显著差异（P>0.05），均在7.95~8.00 之间，这与NAVARRO等[41]的研究结果一致。这表明，添加LSPC 并不影响华夫饼的pH，并非通过改变pH 来抑制美拉德反应生成的AGEs。

图8 不同浓度LSPC 对华夫饼pH 的影响Fig.8 Effects of different concentrations of LSPC on pH in waffles

2.7 莲原花青素对华夫饼色度的影响

添加LSPC 后的华夫饼肉眼可见颜色有所变化，因此采用色度仪对其进行更客观测量。色度仪中L*表示华夫饼的明暗，L*越小，华夫饼越暗；a*表示华夫饼的红绿，a*越大，华夫饼红色越多；b*表示华夫饼的黄蓝，b*越小，华夫饼越蓝。如图9 所示，在实验浓度范围内，随LSPC 的增加，华夫饼颜色更暗、更红[42]、更蓝，且颜色有显著差异性（P＜0.05）。这种现象推测是LSPC 虽然会影响美拉德反应所产生的褐变产物，从而对华夫饼外观颜色有一定影响，但LSPC 本身颜色为红褐色，颜色较深，加入后使华夫饼外观颜色更偏红，颜色加深，亮度减暗。

图9 不同浓度LSPC 对华夫饼色度的影响Fig.9 Effects of different concentrations of LSPC on chroma in waffles注：不同小写字母表示组间（同一色度指标）差异显著（P＜0.05）。

2.8 莲原花青素对华夫饼质构的影响

如表2 所示，对硬度，添加1 mg/g 以上浓度LSPC 华夫饼硬度较未添加和添加0.50 mg/g 浓度LSPC 华夫饼有显著性降低（P＜0.05），这表明添加较高浓度LSPC 能有效增加华夫饼的柔软性；对弹性和凝聚性，添加4 mg/g 浓度LSPC 华夫饼有显著性增加（P＜0.05），这表明高浓度LSPC 华夫饼弹性和凝聚性更好；对胶粘性、咀嚼性、回复性，添加LSPC 与未添加LSPC华夫饼无显著性差异（P>0.05），这表明LSPC 对华夫饼的胶粘性、咀嚼性、回复性无影响。综上，高浓度华夫饼硬度更小更柔软，弹性和凝聚性更好，可以认为高浓度LSPC 华夫饼品质更好。

表2 不同浓度LSPC 华夫饼质构分析Table 2 Texture analysis of waffles with different concentrations of LSPC

2.9 莲原花青素对华夫饼电子鼻PCA 的影响分析

电子鼻是一种利用传感器对样品中不同气体成分进行分析，能够感知和识别气味，进行气味检测的智能系统，具有类似鼻子的功能[43]。本研究采用的PEN3 型电子鼻是一种金属氧化物传感器型的电子鼻，具有10 个金属氧化物气体传感器阵列，如表3所示。

表3 PEN3 型电子鼻传感器敏感物质Table 3 Sensitive substances of PEN3 electronic nose sensor

主成分分析（principal component analysis，PCA）是将研究对象的复杂多指标问题通过特定方式的数据转换，转化为简单且较少数量综合指标的一种重要统计方法，这些综合指标之间既互不相关又能最大化提供研究对象原有指标所反映的绝大部分信息，并能快速实现模式或关系的可视化识别。

如图10 所示，PC1贡献率为76.93%，PC2贡献率为21.41%，总贡献率达到98.34%，说明PCA 可用于区分不同含量LSPC 华夫饼的挥发性气味。在相同的实验条件下，不同添加量的LSPC 华夫饼区分度较明显，0.5、1.0、2.0 和4.0 mg/g LSPC 华夫饼的气味呈现一定的聚类现象，但仍能够有效区分，且不同含量均在各自区域，不发生重叠，说明各组华夫饼之间均存在差异，具有一定的研究价值。电子鼻是一种快速区分不同挥发组分风味差异的有效工具，但对于不同华夫饼之间风味差异物质的表征还有待通过固相微萃取气相色谱-质谱联用技术进一步研究[44]。

图10 不同浓度LSPC 对华夫饼电子鼻PCA 分析Fig.10 PCA analysis of waffle electronic nose with different concentrations of LSPC

2.10 莲原花青素对华夫饼挥发成分气质的GC-MS影响分析

利用GC-MS 在添加不同LSPC 浓度华夫饼中共检测出36 种挥发性化合物。如表4 所示，LSPC-0 样品检测出12 种挥发性化合物，其中，酚类物质1 种，相对含量为42.66%；醛类物质1 种，相对含量为6.86%。LSPC-1、LSPC-2、LSPC-3 和LSPC-4 分别检测出15 种、7 种、8 种和15 种，均无酚类物质和醛类物质。这表明，随LSPC 的添加，使酚类消耗更多，醛类相对含量减少。而醛类物质是产生AGEs的前体物质，间接说明华夫饼中AGEs 的减少，提高了华夫饼的质量安全[45]。酯类化合物是酸、醇在高温作用下生成的产物, 为华夫饼带来果香气和奶气[46]，添加LSPC 后，酯类含量有一定程度地增加，提高了华夫饼的感官品质。

表4 GC-MS 分析风味物质种类Table 4 Flavor substances analysis by GC-MS

3 结论

本研究通过添加不同浓度的LSPC 研究LSPC对华夫饼烘焙过程中美拉德反应AGEs 的抑制作用及感官品质的影响。实验浓度范围内，随LSPC 浓度增加，华夫饼中AGEs 的抑制作用及抗氧化作用呈增加趋势，这表明LSPC 能有效抑制华夫饼中AGEs的形成。感官品质上，随LSPC 浓度的增加，华夫饼色泽逐渐呈棕色，提高食欲。质构分析表明华夫饼添加LSPC 后硬度下降，弹性和凝聚性增强，口感上更为软绵香甜。电子鼻PCA 分析和GC-MS 分析结果显示，不同LSPC 浓度华夫饼的风味存在明显差异，随LSPC 浓度增加，酚类、醛类物质含量减少，酯类物质含量增加。综上，将LSPC 添加至华夫饼中，不仅提高了华夫饼的抗氧化活性，抑制了美拉德反应有害物质AGEs 的生成，同时其感官品质也有一定程度的提升，这使其可能成为一种未来大众膳食中的营养选择。