低共熔溶剂提取的黄精多糖性质分析

刘 旭，孟继坤，葛鑫会，张 楠，裴海生，张秀清,

（1.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083；2.农业部规划设计研究院农产品加工工程研究所，北京 100121）

黄精为百合科植物，其根茎是中国的传统药品，味甘性平，具有补气养阴、健脾、润肺、益肾之功效；2017 年成为新资源食品之一，含有多种营养成分，包括多糖、蛋白质、维生素等，生食、炖服、晒干食用均可。黄精主要分为鸡头黄精（Polygonatum sibiricum）、滇黄精（Polygonatum kingianum）和多花黄精（Polygonatum cyrtonema）。从黄精中分离出多种化合物，包括甾体皂苷类、三萜皂苷类、异黄酮类、生物碱类、木质素类、苯乙肉桂类、多糖和凝集素等[1]。黄精多糖是黄精的主要活性成分之一，具有抗氧化[2−4]、调节糖脂代谢[5−7]、调节免疫[8−9]、抗衰老[10]等活性。

低共熔溶剂（Deep eutectic solvents，DESs）是一种新型的绿色溶剂[11]，呈弱酸性，有助于分解植物细胞壁中的木质素及纤维素，促进植物活性物质的溶出[12]，已被成功应用于植物活性成分的萃取过程中，对天然活性成分表现出高效的提取效果[13−16]。尤其是随着温度的升高，DESs 粘度降低[17]，更有利于植物多糖的提取，但高温对DESs 提取黄精多糖的影响机制还有待研究。

在前期研究中，本团队优化了低共熔溶剂提取黄精多糖的工艺，多糖得率大大提高。70 ℃时低共熔溶剂提取的黄精多糖得率为18%，相比于水提黄精多糖提高了36%。本实验主要研究低共熔溶剂提取的黄精多糖的性质和活性，尤其是对不同温度条件下提取的黄精多糖相对分子量、单糖组成等性质和体外抗氧化活性进行对比分析，为低共熔溶剂提取黄精多糖的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鸡头黄精 湖北省十堰市丹江口市武当山基地；氯化胆碱 上海国药控股化学试剂有限公司；草酸 国药集团化学试剂有限公司；总抗氧化能力试剂盒 南京建成生物工程研究所；无水乙醇、浓盐酸、浓硫酸、磷酸、苯酚、葡萄糖 北京化工厂；甘露糖、鼠李糖、核糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、阿拉伯糖、岩藻糖 标准品，纯度≥99%，Sigma 公司。

Agilent1200 高效液相色谱仪（配有示差检测器和B.03.01 色谱工作站） 安捷伦科技有限公司；岛津LC-20AD 液相色谱仪 岛津有限公司；FD-2A 冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司；TU-1810PU 紫外分光光度计 北京普析通用仪器厂；TG16-WS 台式离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 黄精多糖的提取与制备

1.2.1.1 黄精预处理 取黄精60 ℃干燥6 h，粉碎并过60 目筛。取粉末0.5 g，加入80%乙醇25 mL混匀，超声30 min，4000 r/min 离心10 min，用80%乙醇洗涤沉淀2~3 次，得到黄精沉淀，备用。

1.2.1.2 水提醇沉法提取黄精多糖 参考《中国药典》方法，略有改动。取黄精沉淀按1:50（g/mL）的料液比加入蒸馏水，沸水回流2 h。趁热过滤，保留滤渣备用。浓缩滤液，加入4 倍体积无水乙醇，4 ℃静置12 h，离心后取沉淀冻干，得到黄精粗多糖WPSP。

1.2.1.3 DESs 法提取黄精多糖 参考汪涛等[18]的实验方法，略有改动。将氯化胆碱和草酸按摩尔比1:1 加热混合形成DESs，冷却后保存备用。取黄精按1:20（g/mL）料液比加入DESs，温度70 ℃条件下反应40 min，过滤后取滤液浓缩，加入4 倍体积的无水乙醇，4 ℃静置12 h，离心后取沉淀冻干，得到黄精粗多糖DPSP。为研究低共熔溶剂极端提取条件对黄精多糖性质的影响，将提取温度提高至100 ℃，按前面操作得到黄精粗多糖HDPSP。

1.2.1.4 DESs 法处理WPSP 取1 g WPSP 按1:20（g/mL）料液比加入DESs，温度70 ℃，反应40 min，过滤后取滤液浓缩，加入4 倍体积的无水乙醇，4 ℃静置12 h，离心后取沉淀冻干，得到黄精粗多糖DESWPSP。

1.2.1.5 DESs 法处理滤渣 取1.2.1.2 中的滤渣1 g，采用同1.2.1.4 的方法处理，得到黄精粗多糖DESRPSP。

1.2.2 黄精多糖性质的测定

1.2.2.1 多糖含量的测定 采用苯酚硫酸法[19]。准确吸取0.1 mg/mL 葡萄糖标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 分别置于比色试管中，加蒸馏水补至1.0 mL。各加入5%苯酚1.0 mL 和浓硫酸5.0 mL，摇匀，冷却后于490 nm 条件下测定其吸光值，以水作空白试验，绘制标准曲线，并求得标准线性方程为：y=8.8071x+0.0005，R2=0.9998。取1 mg/mL 样品溶液1.0 mL 采用上述方法测定样品吸光值后，代入标准线性方程计算多糖含量。

1.2.2.2 还原糖含量的测定 参考黄小兰等[20]的方法，绘制标准曲线，并求得标准线性方程为：y=8.8071x+0.0005，R2=0.9998。多糖样品以同样方法测还原糖含量。

1.2.2.3 多糖相对分子量的测定 参考黄奕诚等[21]的方法，略加改动。采用示差折光检测器，安捷伦水相GPC/SEC 色谱柱PL aquagel-OH MIXED-M （8 μm,300 mm×7.5 mm），流动相为水，流速为1.0 mL/min，柱温为30 ℃，1 mg/mL 样品溶液过0.22 μm 滤膜后进样，进样量为20 μL。以保留时间为横坐标，lgMw为纵坐标绘制标准曲线，并求得标准线性方程为：y=−1.0984x+13.66，R2=0.9925。

1.2.2.4 单糖组成的测定 参考周彦强等[22]和张璐等[23]的实验条件，略加改动。仪器为岛津LC-20AD，色谱柱为Xtimate C18（4.6 mm×200 mm，5 μm），柱温为30 ℃，流速为1.0 mL/min，检测波长为250 nm，进样量为20 μL，流动相为0.05 mol/L 磷酸二氢钾溶液：乙腈=83:17。精确吸取50 μg/mL 混合对照标准品溶液（甘露糖、鼠李糖、核糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、阿拉伯糖、岩藻糖）250 μL，加入0.6 mol/L NaOH 溶液250 μL、0.4 mol/L 的PMP-甲醇500 μL，70 ℃反应1 h。冷却后加入0.3 mol/L HCl 500 μL、1 mL 氯仿混匀，离心后取上清，萃取3 次。上清用于HPLC。样品测定方法与标准品相同。

1.2.3 多糖抗氧化活性的测定

1.2.3.1 DPPH 自由基清除能力的测定 参考Wang等[24]的实验方法并略加改动。取500 μL 不同浓度的WPSP、DPSP 和HDPSP 溶液（0.5~3.0 mg/mL），加入0.1 mg/mL DPPH 乙醇溶液500 μL，混匀后黑暗中放置30 min，于517 nm 处测吸光度值A1；以无水乙醇代替DPPH 乙醇溶液进行实验，测定样品溶液本底的吸光度值A2；以蒸馏水代替样品进行实验，测定空白对照组的吸光度值A0。DPPH 自由基的清除率为：

1.2.3.2 羟基自由基清除能力的测定 参考Ling 等[25]的实验方法并略加改动。取500 μL 不同浓度的WPSP、DPSP 和HDPSP 溶液（0.5~3.0 mg/mL），加入2 mg/mL FeSO4溶 液150 μL、1% H2O2溶 液500 μL、1.5 mg/mL 水杨酸乙醇溶液500 μL 混匀，37 ℃水浴1 h，于526 nm 处测定吸光度值B1；以无水乙醇代替水杨酸乙醇溶液进行实验，测定样品溶液本底的吸光度值B2；以蒸馏水代替样品进行实验，测定空白对照组的吸光度值B0。羟基自由基清除率为：

1.2.3.3 总抗氧化能力（T-AOC）的测定 参照总抗氧化能力（T-AOC）测定试剂盒中的操作方法：依次加入试剂一1 mL、0.5 mL 不同浓度的WPSP、DPSP和HDPSP 溶液（0.5~3.0 mg/mL）、试剂二应用液2 mL、试剂三应用液0.5 mL 混匀，37 ℃水浴30 min，加入0.1 mL 的试剂四混匀，静置10 min，于波长520 nm 处测定各管吸光度值。以蒸馏水替代样品溶液，同样步骤加入试剂一至四，测定，为对照管吸光度值。

式中：在37 ℃时每分钟每毫克多糖使反应体系的吸光度值每增加0.01 时为1 U；对照管的吸光度记为C0；样品管的吸光度记为C1。

1.3 数据处理

所有试验数据使用IBM SPSS Statistics 20 软件进行处理，结果均用平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 不同方法提取黄精多糖得率的比较

传统水提醇沉提取的多糖（WPSP）、70 ℃条件下DESs 法提取的多糖（DPSP）和100 ℃条件DESs法提取的多糖（HDPSP）的得率和还原糖含量如图1所示。70 ℃低共熔溶剂法提取黄精多糖得率为18%，相较于传统水提醇沉法得率提高了36%；且DPSP的还原糖含量比WPSP 提高了77%，这可能是由于低共熔溶剂对多糖分子长链具有打断作用，产生了更多的低分子量多糖或者有更多的还原性基团暴露出来，从而引起还原性末端含量升高。但是100 ℃ 条件下低共熔溶剂法提取得到的黄精多糖HDPSP 得率和还原糖含量都有所降低，其机理尚不清晰。

图1 提取方法对还原糖含量（A）和得率（B）的影响Fig.1 Effects of extraction methods on reducing sugar content(A) and yield (B)

2.2 不同方法提取黄精多糖分子量的比较

为了研究DESs 对多糖的作用，在WPSP、DPSD、HDPSP 之外，用DESs 处理WPSP 后得到了多糖DES-WPSP，用DESs 处理传统水提多糖剩余的渣滓得到了多糖DES-RPSP。5 种黄精多糖的GPC 分子量测定保留时间-信号图如图2 所示，分子量汇总结果如表1 所示。通过B、C、D 和A 的对比，峰a、b的含量变少甚至消失，并出现新的峰c，说明DESs处理对黄精多糖具有降低分子量的作用。而且通过C、D 的对比发现没有新增加的峰且峰形相似，说明DESs 法可以进一步将黄精渣滓内剩余的多糖RPSP更充分地提取出来。E 是多糖HDPSP 的GPC 分子量测定结果，可以发现分子量较为集中，分子量为4.8 kDa。

图2 黄精多糖的GPC 分子量检测图Fig.2 GPC molecular weight detection diagram ofPolygonatum sibiricumpolysaccharides注：A、B、C、D、E 分别是WPSP、DPSP、DES-WPSP、DESRPSP、HDPSP 的GPC 分子量测定曲线；线a、b、c、d 处所代表 的 相 对 分 子 量 分 别 是1.01×108、4.22×106、8.50×103、4.06×103Da；峰e、f 分别是氯化胆碱峰和草酸GPC 峰。

表1 不同处理条件下黄精多糖的分子量Table 1 Molecular weight ofPolygonatum sibiricumpolysaccharide under different treatment conditions

2.3 不同方法提取黄精多糖单糖组成的比较

为了研究DESs 提取对黄精多糖单糖组成的影响，本实验对WPSP、DPSP、HDPSP、DES-WPSP、DES-RPSP 多糖的单糖组成进行分析比较，结果如表2。这几种多糖的单糖组成以甘露糖、葡萄糖和半乳糖为主要成分，还含有鼠李糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸等。经过DESs 处理的多糖相较于水提醇沉法得到的多糖在单糖组成上差异明显。由于DESWPSP 为DESs 直接降解多糖、DPSP 为边提取黄精多糖边降解多糖、DES-RPSP 为边提取黄精渣滓多糖边降解多糖，按照此顺序，随着体系中多糖与DESs接触面积比例的减小，甘露糖含量逐渐降低，DESRPSP 的甘露糖含量为4.04%；半乳糖含量逐渐升高，DES-RPSP 的半乳糖含量为72.85%。HDPSP 的单糖组成变化最为明显，除葡萄糖及其醛酸含量升高及核糖、木糖含量基本不变外，其他的单糖含量均降低，可能是因为低共熔溶剂剧烈的降解作用引起了单糖的丢失，导致这些单糖含量降低。

表2 五种黄精多糖中单糖组分含量的比较（%）Table 2 Comparison of five kinds of PSPs’ monosaccharides components(%)

2.4 不同方法提取黄精多糖体外抗氧化活性的比较

2.4.1 DPPH 自由基清除能力 DPPH 分析法是用来筛选自由基清除剂和判断抗氧化活性的常见方法，抗氧化剂的清除能力可以用DPPH 自由基半数清除率（IC50值）时抗氧化剂的浓度来表示。对WPSP、DPSP、HDPSP 的DPPH 自由基清除能力进行测定，结果如图3。在0.5~3.0 mg/mL 的范围内，DPSP和HDPSP 的DPPH 自由基清除率随浓度的提高而增强，且在此范围内，DPSP 的清除能力都比同浓度下的WPSP 和HDPSP 高。WPSP、DPSP、HDPSP的半数清除率分别是3.89、2.50、15.63 mg/mL，即DPPH 自由基的清除能力从高到低依次是DPSP、WPSP、HDPSP。

图3 三种黄精多糖对DPPH 自由基清除能力的比较Fig.3 Comparison of DPPH radical scavenging ability of threePolygonatum sibiricumpolysaccharides

2.4.2 羟自由基清除能力 利用Fenton 反应产生羟自由基，通过对比羟自由基清除率来反映抗氧化剂的抗氧化能力。三种多糖WPSP、DPSP、HDPSP 对羟自由基清除能力如下图4 所示。在0.5~3.0 mg/mL的浓度范围内，多糖对羟自由基清除能力随浓度的升高而增强。WPSP、DPSP、HDPSP 对羟自由基半数清除率分别是8.87、4.70、11.18 mg/mL，即羟自由基清除能力从高到低依次是DPSP、WPSP、HDPSP。

图4 三种黄精多糖对羟自由基清除能力的比较Fig.4 Comparison of hydroxyl radical scavenging ability of threePolygonatum sibiricumpolysaccharides

2.4.3 总抗氧化能力 采用T-AOC 法测得三种多糖WPSP、DPSP、HDPSP 总抗氧化能力如下图5 所示。随着多糖浓度的升高，多糖的总抗氧化能力增强。当浓度为3.0 mg/mL 时，DPSP 的总抗氧化能力为4.5 U/mL，是WPSP 的4.3 倍，是HDPSP 的7.4 倍。它们的总抗氧化能力的高低依次是：DPSP、WPSP、HDPSP。

图5 三种黄精多糖总抗氧化能力的比较Fig.5 Comparison of the total antioxidant capacity of threePolygonatum sibiricumpolysaccharides

3 讨论与结论

DESs 提取可以有效提高黄精多糖的得率，而且得到的多糖在分子量、单糖组成、抗氧化能力等性质方面存在差异。DESs 法提取生黄精多糖得率为18%，比经典水提法提高了36%，但是其作用机理尚不清晰。张成武[26]研究发现大多数低共熔溶剂一定程度上破坏了纤维素分子内氢键，使纤维素的结晶度降低、表面变得粗糙。低共熔溶剂对木质素和纤维素的破坏，有利于DESs 通过植物纤维层提取多糖，大部分多糖能通过氢键作用被提取出来。结果表明，DESs 可以降低黄精多糖分子量，当温度提高至100 ℃时，大部分的多糖分子量被降低至4 kDa 左右。此外，从水提取后剩余的黄精渣滓中采用DESs法再次提取，得到的多糖GPC 测定结果中没有新的峰出现。DESs 可以将水提得到的多糖分子打开，分子量降低，并进一步将渣滓里的残留多糖更充分地提取出来。黄精多糖分子量的降低，可能会促进机体对多糖的吸收[27−28]，但还需要进一步的验证。

黄精多糖是以甘露糖、葡萄糖和半乳糖为主的多聚糖。和WPSP 相比，DESs 处理黄精多糖会引起单糖组成的变化，尤其是甘露糖和半乳糖的比例。具体DESs 的作用机制，还需进一步纯化黄精多糖，或者采用模式寡糖为原料，探究DESs 降解黄精多糖后多糖结构和组分的变化。

低共熔溶剂提取的多糖有更好的体外抗氧化活性。黄秀红等[29]根据茶多糖的特性优化茶多糖低共熔溶剂提取工艺，与经典水提醇沉法相比，茶多糖得率、DPPH 自由基抗氧化能力和羟自由基抗氧化能力分别提高了20%、54%、33%。Shang 等[30]的研究发现海胆多糖经低共熔溶剂处理后具有良好的体外抗氧化活性。本研究体外抗氧化试验中，DPSP 具有更好的体外抗氧化活性，这可能是因为黄精多糖经DESs 在70 ℃温度下打开分子链，官能团暴露增加，还原性末端含量增加。研究结果可以为低共熔溶剂在黄精多糖提取方面的应用提供科学参考，促进黄精的开发利用，提升黄精多糖的药用价值和经济价值。