薯蓣皂苷对异丙肾上腺素诱导的大鼠心肌纤维化的作用及机制研究*

程 阳，葛晨亮，范奕好，何 燕

（广西医科大学第一附属医院，南宁 530021）

心肌纤维化（myocardial fibrosis，MF）是多种心血管疾病发生发展的病理基础，其主要的特征为成纤维细胞聚集和细胞外基质蛋白的过度沉积，引起心脏功能受损，最终导致心室扩大、心肌细胞肥大和凋亡以及充血性心力衰竭的发生[1-2]。MF的发生机制复杂，心脏组织在炎症反应、心肌缺血及创伤过程中均可发生MF 的改变[3-4]。研究表明，核苷酸结合寡聚化结构域样受体3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors 3，NLRP3）在MF 过程中被广泛激活，参与了MF 的慢性炎症过程[5]。NLRP3炎症小体是炎症小体家族中与疾病关系最密切且研究最充分的一员，其激活后可促使半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1前体（pro-caspase-1）自我剪切为caspase-1，进而促进炎症因子白介素（IL）-1β和IL-18 的激活和释放，可诱导或加重MF 进程[6-7]。因此，抑制NLRP3 炎症小体的过度激活，减少炎症因子IL-1β和IL-18的释放，可有效减轻MF的发生。

薯蓣皂苷（dioscin）是薯蓣科植物的主要成分之一，具有抗炎、抗肿瘤、抗血栓形成等作用[8]。研究表明，薯蓣皂苷能有效减轻心肌缺血再灌注损伤、心室重构和心肌肥厚的发生，从而对冠心病、糖尿病性心肌病和心力衰竭等疾病具有改善作用[9-11]。然而，目前对于薯蓣皂苷抗MF 作用及其分子机制研究较少，本研究旨在探究其抗MF的机制，为临床治疗心血管疾病提供参考。

1 材料与方法

1.1 药品及试剂 薯蓣皂苷试剂（MCE 公司），盐酸异丙肾上腺素（Solarbio公司），GAPDH抗体（Abcam 公司），NLRP3 抗体（BIOSS 公司），pro-caspase-1 及caspase-1 p20 抗体（Abmart 公司），IL-1β 抗体（Wanleibio公司），IL-18抗体（Wanleibio公司）。

1.2 实验动物 雄性SD大鼠24只，6～8周龄，购买自长沙天勤生物公司，许可证号：SCXK（湘）2019-0014，使用许可证编号：SYXK桂2014-0002，饲养于广西医科大学动物实验中心，适应性喂养7 d，12 h光照、黑暗交替，大鼠可自由进食、饮水。本实验已获得广西医科大学动物实验伦理委员会批准。

1.3 MF模型建立及给药方案 将24只SD大鼠随机分为对照组、模型组、薯蓣皂苷低剂量组、薯蓣皂苷高剂量组。模型组和薯蓣皂苷低、高剂量组背部皮下注射异丙肾上腺素（ISO，5 mg/kg·d-1），对照组皮下注射等量生理盐水，连续给药10 d，诱导大鼠MF 模型；同时薯蓣皂苷低、高剂量组分别灌胃30 mg/kg·d-1、60 mg/kg·d-1的薯蓣皂苷溶液，连续10 d，对照组和模型组灌胃等量生理盐水。

1.4 大鼠心脏指数的计算 各组大鼠在末次给药后称取体重，使用10%水合氯醛深度麻醉后向大鼠右心室注射生理盐水，通过心脏搏动将生理盐水泵入循环到达每个心腔，心脏灌流去除心腔内的残留血液，处死大鼠后解剖取得大鼠心脏并称重，心脏指数=心脏重量（mg）/体重（g）。

1.5 大鼠心脏组织苏木精—伊红（HE）染色和masson 染色 将大鼠心脏组织固定于10%多聚甲醛中，使用梯度乙醇脱水后石蜡包埋，制成5 μm 的切片，使用HE染色，于光学显微镜下观察切片并采集图像；行masson 三色染色，显微镜下观察切片并采集图像，使用Image J 6.0 软件分析心肌胶原容积分数（collagen volume fraction，CVF），即胶原纤维面积/总面积。

1.6 免疫组织化学染色法检测心肌组织胶原蛋白（Collagen）Ⅰ、Collagen Ⅲ、IL-1β、IL-18蛋白的表达 大鼠心脏组织脱蜡至水，使用10%山羊血清于室温下封闭30 min，将组织分别浸泡于Collagen Ⅰ（1∶200）、Collagen Ⅲ（1∶1 000）、IL-1β（1∶400）、IL-18（1∶400）抗体中4 ℃孵育过夜，经PBS冲洗后加入相应二抗（1∶200）室温孵育1 h，用二氨基联苯胺染色后于光学显微镜下观察切片并采集图像，使用Image J 6.0 软件分析免疫组化Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、IL-1β、IL-18蛋白的相对表达量，计算各项指标免疫组化DAB染色阳性比例。

1.7 免疫印迹法（Western blotting）检测NLRP3、pro-caspase-1、caspase-1 p20蛋白的表达 将低温保存的心肌组织从-80 ℃冰箱取出，按1∶100比例加入RIPA裂解液和蛋白酶抑制剂，使用低温组织研磨仪在4 ℃80 Hz 条件下充分研磨，4 ℃12 000 r/min 10 min 离心取上清液即组织蛋白溶液。使用BCA试剂盒测定蛋白浓度。蛋白样品使用12%的SDSPAGE的分离胶分离，并转移至PVDF膜上，使用5%的奶粉封闭1.5 h 后用TBST 溶液清洗，随后分别加入到GAPDH（1∶5 000）、NLRP3（1∶2 000）、pro-caspase-1（1∶1 000）、caspase-1 p20（1∶1 000）一抗中4 ℃孵育过夜，TBST洗膜后于对应二抗（1∶5 000）中孵育1 h，化学发光显影后使用Image J 6.0分析条带灰度，将目的条带分别与相应GAPDH 进行标准化处理。

1.8 统计学方法 采用SPSS 22.0对数据进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Tukey法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠心脏组织HE、masson 染色结果及心重指数、胶原容积分数比较结果 与对照组比较，模型组MF 面积、心脏指数增加（P＜0.05）；与模型组相比，薯蓣皂苷低、高剂量组MF 面积，心脏指数降低（P＜0.05）；大鼠心肌组织HE染色结果显示，与对照组比较，模型组炎症细胞浸润明显加重，而薯蓣皂苷低、高剂量组炎症细胞的浸润水平较模型组减轻，见图1。

图1 masson染色和HE染色检测薯蓣皂苷对ISO诱导的大鼠MF影响

2.2 各组大鼠心脏组织Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ的表达结果比较 与对照组比较，模型组大鼠心肌组织Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ表达均增加（均P＜0.05），与模型组相比，薯蓣皂苷低、高剂量组大鼠心肌组织Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ表达量均降低（均P＜0.05），见图2。

图2 免疫组化染色检测Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ表达量

2.3 各组大鼠心脏组织IL-1β 和IL-18 表达比较结果 与对照组比较，模型组大鼠心肌组织IL-1β、IL-18表达增加（P＜0.05），与模型组相比，薯蓣皂苷低、高剂量组IL-1β、IL-18表达降低（P＜0.05），见图3。

图3 免疫组化染色检测IL-1β、IL-18相对表达量

2.4 各组大鼠心脏组织NLRP3、pro-caspase-1 和caspase-1 p20 蛋白表达比较 与对照组比较，模型组大鼠心肌组织NLRP3、caspase-1 p20 蛋白相对表达量升高（P＜0.05）；与模型组相比，薯蓣皂苷低、高剂量组NLRP3、caspase-1 p20 蛋白相对表达量降低（P＜0.05）；各组间大鼠心肌组织pro-caspase-1蛋白相对表达量比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见图4。

图4 Western blotting检测NLRP3炎症小体表达量

3 讨论

MF 是心血管疾病中较常见的病理改变，临床中多种心血管疾病均会发生不同程度的MF 表现，如高血压性心脏病、冠状动脉粥样硬化性心脏病、慢性心力衰竭等[12-14]。MF 的基本特征为心脏间质成纤维细胞异常增殖，心肌间质和血管周围胶原纤维过量蓄积，各型胶原蛋白（如Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ等）比例失调以及分布异常[15]，最终导致心脏发生不可逆的病理改变，引起组织顺应性下降和心室扩张，从而加速疾病进程。目前临床上尚缺少治疗MF 的特效药物，β 受体阻滞剂、血管紧张素受体脑啡肽酶抑制剂、醛固酮受体拮抗剂和钠—葡萄糖协同转运蛋白2抑制剂等药物虽然在一定程度上可以改善心脏功能和心衰患者的预后，但并不能逆转MF改变[16]。因此，对于抗MF药物的研发是目前亟待解决的问题之一。

薯蓣皂苷为皂苷类化合物，是薯蓣科植物的重要活性成分，具有良好的抗炎、抗损伤作用。近年研究显示，薯蓣皂苷对心血管系统也有良好的保护作用，可减少心脏氧化应激损伤和缺血再灌注后心律失常等的发生[17-18]。在本研究中，给予大鼠连续10 d的ISO注射后，其心脏组织胶原容积分数、心脏指数升高，同时Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ的表达增加，而给予薯蓣皂苷处理后可使大鼠心脏组织胶原容积分数、心脏指数降低，Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ的表达下降，表明薯蓣皂苷对心肌成纤维细胞的活化和MF有抑制作用。

MF 的机制现在尚未完全阐明，但多项研究表明，其发生过程与炎症激活密切相关。心肌组织发生缺血、炎症或创伤时，损伤心肌释放的促纤维化因子也可激活包括炎症小体在内的天然免疫，NLRP3炎症小体也参与其中[19]。NLRP3是炎症小体家族中重要的一员，在心肌组织中具有较高的表达，其通过凋亡相关斑点蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC）与procaspase-1 发生相互结合，促使pro-caspase-1 自我剪切为具有功能的caspase-1，促进炎症因子IL-1β、IL-18 的成熟和释放，从而导致心肌炎症反应和MF 的形成[20]。本研究亦发现，予以ISO 处理后可诱导大鼠MF的发生，与此同时，心肌组织NLRP3、caspase-1 p20 表达增高，IL-1β、IL-18 的释放增加，表明MF的发生与NLRP3 炎症小体的激活密切相关。目前大量研究证实，薯蓣皂苷具有抑制NLRP3炎症小体激活的作用[21-23]。本研究显示，薯蓣皂苷可逆转由ISO所致的大鼠心脏组织NLRP3、caspase-1 p20、IL-1β、IL-18 的升高，提示薯蓣皂苷可能通过抑制NLRP3炎症小体的表达而降低MF的发生。

综上，薯蓣皂苷可减轻ISO 诱导的大鼠MF，其机制可能与抑制NLRP3 炎症小体激活相关。薯蓣皂苷可能成为MF 候选治疗药物，具有潜在的临床应用价值，为心血管疾病的治疗提供临床参考。