鼻咽癌细胞体外诱导肿瘤相关成纤维细胞形成并上调NNMT表达*

杨雨嘉，姚 茜,2，霍慧敏，崔 昆，姚小暄,，黄中恒,，唐锦平,，刘春磊,，韦正波，谢 莹,2△

（1.广西医科大学生命科学研究院，南宁 530021；2.广西区域性高发肿瘤早期防治研究教育部重点实验室，南宁 530021；3.广西医科大学附属肿瘤医院，南宁 530021）

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是起源于鼻咽上皮细胞且在中国南方地区高发的恶性肿瘤，淋巴结转移是其早期主要临床表现[1]。自1889 年Steven Pegat 提出肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）学说以来，TME 与肿瘤发生、发展的关系越来越受关注[2-3]。TME包括肿瘤细胞、基质细胞如肿瘤相关内皮细胞（tumor-associated endothelial cells，TECs）、肿瘤相关成纤维细胞（cancerassociated fibroblasts，CAFs）、肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages，TAMs）等细胞成分及多种非细胞成分。其中CAFs 作为TME 中最重要的基质细胞之一，通过直接接触、旁分泌、重塑细胞外基质、诱导血管形成等方式对肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭起到营养支持和促进作用[4-5]。

烟酰胺-N-甲基转移酶（nicotinamide N-methyltransferase，NNMT）编码基因位于人类11 号染色体上（11q23.1），有3个外显子和2个内含子，转录位点跨度约为16.7 kb，产生包含1 578 个碱基对的mRNA和264个氨基酸的蛋白质。单细胞测序结果显示，NNMT 在成纤维细胞和肿瘤细胞中呈高表达，被普遍认为是一种肿瘤相关代谢酶，可改变多种肿瘤细胞的代谢途径，显著促进肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭[6-8]。另有最新研究报道，NNMT在CAFs中呈高度表达，可能是CAFs活化的关键蛋白，敲低CAFs 中NNMT 表达后，α-平滑肌肌动蛋白（αsmooth muscle actin，α-SMA）表达下调[9]。本研究拟通过条件培养基（condition medium，CM）和Transwell小室共培养模式，将人胚肺成纤维细胞MRC-5与NPC 细胞系5-8F 共培养后诱导MRC-5 向CAFs转化，检测NNMT及成纤维细胞生物标志物的表达情况和细胞增殖能力；同时分离纯化头颈肿瘤来源CAFs，验证相关标志物表达，探讨NNMT 与CAFs的相关性。

1 材料与方法

1.1 肿瘤组织来源和细胞培养

肿瘤组织取自广西医科大学附属肿瘤医院的2例头颈外科手术患者。本研究经广西医科大学医学伦理委员会审核通过，患者及其家属均已签署知情同意书。

人NPC 细胞株5-8F 购自湖南湘雅中心实验室细胞库。人胚肺二倍体成纤维样细胞株MRC-5 由中国科学院干细胞库提供。5-8F、MRC-5、CAFs 均培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，并置于37 ℃、5%CO2的培养箱中常规培养，隔天换液，细胞生长至80%～90%融合度时，0.25%胰酶消化、传代。

1.2 主要试剂

DMEM 培养基、胎牛血清、青—链霉素均购自美国Gibco公司；α-SMA鼠单克隆抗体、NNMT鼠单克隆抗体、GAPDH 兔单克隆抗体、山羊抗兔二抗、山羊抗小鼠二抗均购自英国Abcam公司；Transwell小室（0.4 μm 孔径）、6孔细胞培养板购自美国Corning 公司；逆转录试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；PowerUp™SYBR™Green Master Mix 购自美国Thermo Fisher生物技术有限公司；CCK-8试剂购自日本东仁公司。

1.3 间接接触共培养

1.3.1 CM共培养体系

采用本课题组前期建立的CM 共培养体系[10]，见图1A。（1）5-8F-CM 和CM-control（来源于MRC-5）的收集：取对数生长期的5-8F 或MRC-5 分别接种于6孔板，培养至细胞融合度为70%时，吸弃培养基，PBS 清洗，加入含2%胎牛血清的DMEM 培养基，继续培养48 h后收集培养上清液，用0.22 μm孔径的滤器滤除细胞碎片及死细胞。（2）CM共培养体系的构建：实验组（MRC-5+5-8F-CM组）：将MRC-5细胞以3×105个/孔的密度接种于6 孔板，培养12 h后弃去培养基，PBS 清洗，随后加入5-8F-CM 与含2%胎牛血清的DMEM 新鲜培养基（按1∶1 比例混合）；对照组（MRC-5+CM-control组）：加入CM-control与含2%胎牛血清的DMEM培养基（按1∶1比例混合）。培养48 h后收集各组细胞。

图1 体外间接接触共培养体系模型

1.3.2 Transwell小室共培养体系

构建Transwell 小室（0.4 μm 孔径）共培养体系[11]，以共培养后的Transwell 下室MRC-5 细胞和6 孔板单独培养的MRC-5 细胞作为目标细胞，见图1B。实验组（C-MRC-5 组）：取对数生长期的5-8F以3×105个/孔的密度接种于上室内，MRC-5以3×105个/孔的密度接种于下室（6 孔板）内。对照组（NMRC-5 组）：将MRC-5 细胞以3×105个/孔的密度接种于6 孔板中单独培养。48 h 后收集各组下室细胞。

1.4 头颈肿瘤相关成纤维样细胞的分离与纯化

用含1%青—链霉素的PBS 缓冲液多次清洗头颈部肿瘤组织，去除脂肪组织，剪成1 mm×1 mm×1 mm 小块，加入含Ⅰ型胶原酶、透明质酸酶Ⅳ型、DNaseⅠ型的酶解液，37 ℃消化20～40 min，离心去除酶解液，PBS 清洗两次，用含10%胎牛血清的DMEM 完全培养基重悬，移入培养瓶，差速贴壁法纯化CAFs。将获得的两株头颈肿瘤来源CAFs 分别记为Fb-F0004和Fb-F0005。

1.5 倒置相差显微镜观察细胞形态

将两种诱导模型下经5-8F 细胞诱导前、后的MRC-5与头颈肿瘤来源的CAFs分别置于倒置相差显微镜下观察并进行拍照。

1.6 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）

采用TRIzol 法从细胞中提取总RNA，并通过Nanodrop One 微量UV-Vis 分光光度计（Thermo 美国）检测其纯度和浓度，OD260/280在1.9～2.1的样本按照逆转录试剂盒的说明书逆转录为cDNA，以此为模板进行PCR扩增，采用2－△△CT法计算目的基因相对表达量，以GAPDH为内参，设计引物，见表1。

表1 PCR基因引物序列

1.7 CCK-8法检测细胞增殖能力

将MRC-5 按1×103个/100 μL 密度接种于96 孔板中，每组设5 个复孔，待细胞贴壁完全后，分别加入CM-control及5-8F-CM。分别于24 h、48 h、72 h、96 h、120 h 更换CCK-8工作液（CM-control或5-8FCM∶CCK-8试剂=9∶1），37 ℃避光孵育4 h后通过全波长酶标仪（Thermo 美国）测定450 nm波长处各孔的吸光度（OD）值。

1.8 Western blotting法检测α-SMA、NNMT蛋白表达

提取各组细胞总蛋白，BCA 法检测蛋白浓度，加入4×LDS Sample Loading Buffer，加热使蛋白变性；NuPAGE Bis-Tris电泳分离蛋白，转至PVDF膜，5% BSA 封闭1 h；加入一抗α-SMA、NNMT、GAPDH（均1∶1 000）4 ℃孵育过夜，TBST 洗膜，加入二抗（1∶15 000）室温下避光孵育1.5 h后，TBST洗膜，双色红外成像系统扫描结果。采用Image J 软件分析蛋白条带灰度值。

1.9 统计学方法

采用SPSS 21.0 统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 5-8F诱导MRC-5的形态学观察

MRC-5 形态多呈梭形、多角形、不规则形。经5-8F 细胞CM 诱导（MRC-5+5-8F-CM）和Transwell小室共培养诱导（C-MRC-5）后的MRC-5 生长速度较快，排列较紊乱，见图2。

图2 成纤维细胞诱导前、后的形态学特征（×40）

2.2 各组细胞NNMT 及CAFs 相关标志物的基因表达水平比较

两种共培养模式诱导48 h 后进行RT-qPCR 检测，结果显示：两种培养模式的MRC-5 细胞α-SMA、FAP、Vimentin和NNMT表达均升高，且α-SMA和Vimentin在Transwell 小室共培养模式下的表达上升更明显，见表2。

表2 各组细胞α-SMA、FAP、FSP-1、Vimentin和NNMT mRNA相对表达量比较±s，n=3

表2 各组细胞α-SMA、FAP、FSP-1、Vimentin和NNMT mRNA相对表达量比较±s，n=3

与MRC-5+CM-control 组比较，*P＜0.05；与N-MRC-5 组比较，#P＜0.05；与MRC-5+5-8F-CM 组比较，△P＜0.001。

2.3 CM 共培养模式下5-8F-CM 对MRC-5 增殖能力的影响

与MRC-5+CM-control 组比较，MRC-5+5-8FCM组MRC-5细胞的增殖能力增强，见图3。

图3 NPC 5-8F 上清液对NPC 相关成纤维细胞增殖能力的影响

2.4 头颈肿瘤来源成纤维细胞的形态学观察

镜下观察两例头颈肿瘤相关CAFs，形态均呈梭形，细胞轮廓结构清晰，核仁较大且明显，见图4。

图4 头颈肿瘤来源成纤维细胞的形态学特征（×40）

2.5 CAFs相关标志物表达情况

与5-8F细胞比较，两例头颈肿瘤临床样本来源的CAFs（Fb-F0004 和Fb-F0005）中EPCAM表达量降低，与MRC-5 相似，可排除上皮细胞污染；Fb-F0004中所有CAFs生物标志物表达均高于MRC-5，Fb-F0005 中FAP、FSP-1、Vimentin及IL-6基因表达量高于MRC-5；两株CAFs 中NNMT表达均高于MRC-5，见表3。

表3 各组CAFs中α-SMA、FAP、FSP-1、Vimentin、NNMT、IL-6和EPCAM基因表达量比较±s

表3 各组CAFs中α-SMA、FAP、FSP-1、Vimentin、NNMT、IL-6和EPCAM基因表达量比较±s

与MRC-5组比较，*P＜0.05；与5-8F组比较，#P＜0.05。

2.6 CAFs中α-SMA和NNMT的蛋白表达水平

与MRC-5比较，NNMT在两株临床样本来源的CAFs 中的表达均上调，而α-SMA 仅在Fb-F0004 中的表达上调，见图5。

图5 α-SMA和NNMT在头颈肿瘤成纤维细胞和MRC-5中的蛋白表达

3 讨论

CAFs 是TME 中最主要的支持细胞之一，与肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭、耐药、抗凋亡与免疫逃逸密切相关[12-14]。NNMT 主要将S-腺苷-甲硫氨酸（Sadenosyl-L-methionine，SAM）的活性甲基转移至烟酰胺（nicotinamide，NA），生成甲基烟酰胺（methyl nicotinamide，MNA）和S-腺苷-同型半胱氨酸（S-adenosyl-L-homocysteine，SAH）[15]。Eckert 等[9]研究表明，NNMT 介导的SAM 缺失和甲基化潜能降低是调节CAFs 分化的关键机制。因此，NNMT参与的细胞代谢与表观遗传调控可能是TME中CAFs重要的代谢途径，促进肿瘤发生、发展。本课题组通过两种体外间接接触共培养诱导MRC-5 向CAFs 转化，结果显示，CAFs 的NNMT 蛋白表达上调，且Transwell小室共培养较CM共培养能更有效地提高CAFs 相关标志物的表达，考虑原因有两方面：（1）相较于CM 共培养，Transwell 小室共培养方式是两种细胞相互影响，更符合体外TME模型；（2）相较于CM 共培养，使用低FBS 培养获得的CM 受细胞数量与状态影响较大，Transwell小室共培养方式使用完全培养基，对细胞生长状态更有利。因此，Transwell小室共培养可能是体外诱导CAFs的良好的共培养模型构建方式之一。

FSP-1 和Vimentin为成纤维细胞标志物，α-SMA 和FAP 为CAFs 标志物；EPCAM 为上 皮细胞标志物，在成纤维细胞中不表达，本研究采用NPC上皮细胞系5-8F作为阳性对照，头颈肿瘤组织来源的CAFs无上皮细胞混杂；IL-6也被认为与CAFs形成相关[7,16-19]。本研究结果显示，2 例头颈肿瘤来源的CAFs 分为两类不同的亚型：一种是肌纤维母细胞（myofibroblastic CAFs，myCAFs），α-SMA 表达较高，IL-6表达较低，可能为上皮细胞间充质转化形成的；另一种是炎症性CAFs（inflammatory CAFs，iCAFs），α-SMA表达较低，IL-6表达较高，通常由肿瘤间质旁分泌诱导产生[20]。因NPC生长部位特殊，局部肿瘤组织较小，其CAFs体外培养尚未成功，本研究从其解剖结构比邻的头颈肿瘤组织（口底癌）中获取了2 例CAFs，其α-SMA表达不一致，但NNMT基因和蛋白均呈高表达，提示NNMT有可能成为更有效的CAFs标记物。

综上所述，本研究通过体外间接接触共培养方式模拟体内TME，诱导CAFs，并从头颈部肿瘤组织分离的CAFs 中均检测到CAFs 相关标志物及NNMT 的表达水平升高，且CAFs 显示出较高的增殖能力，为后续NNMT与CAFs促进肿瘤发生、发展的分子机制研究奠定基础。