2 型糖尿病患者外周血Th1、Th2 的表达及相关性研究

王坤，吴月静，王兴珍，励丽

目前，我国糖尿病患病率增加趋势明显，2015 年至2017 年中华医学会内分泌学分会的流行病学调查显示我国18岁及以上人群糖尿病患病率为11.2%，其中2 型糖尿病占90%以上[1]。过去一直认为2 型糖尿病是遗传与环境因素共同作用的结果，近年来出现了一个崭新的医学科学方向-免疫代谢学[2]，主要研究内容为免疫与代谢在生理及各种疾病中的相互影响。研究发现，适应性免疫调节尤其是CD4+T淋巴细胞亚群在2 型糖尿病的发生发展过程中发挥重要的作用[3]。CD4+T 淋巴细胞亚群根据其功能和产生细胞因子的类型，可以分为促炎性Th1 细胞和抗炎性Th2 细胞。本文通过比较健康人群与初发2 型糖尿病患者外周血Th1 和Th2 的表达差异，分析其相关性并为进一步探索免疫机制在2 型糖尿病发病过程中的作用提供依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2021 年7-11 月在宁波市第一医院内分泌门诊就诊的2型糖尿病患者作为观察组，其中男13 例，女17 例；年龄（48.0±12.3）岁。另选择同期无糖耐量、尿酸及高胰岛素血症等代谢指标异常的正常志愿者10 例作为健康对照组，男5 例，女5 例；年龄（39.0±11.5）岁。两组的性别、年龄等一般情况差异无统计学意义（P ＞0.05）。本研究符合医学伦理学标准，且已获得本院伦理委员会批准，所有检测均获得患者的知情同意并签署知情同意书。

1.2 纳入及排除标准 纳入标准：（1）符合WHO 2 型糖尿病诊断标准，年龄≥18 岁；（2）体质量指数（BMI）≥19 kg/m2；（3）签署知情同意书；（4）未使用过任何降糖药物（包括各类中药）。排除标准：（1）受检者本人或直系亲属有自身免疫性疾病史（如1 型糖尿病、风湿性疾病等）；（2）近期有不明原因发热；（3）存在感染等其他原因引起的炎症状态；（4）肿瘤患者。

1.3 方法

1.3.1 标本和数据采集 记录所有研究对象一般资料，包括性别、年龄、身高及BMI；测量颈围、腰围、臀围，测量内脏脂肪面积和皮下脂肪面积；抽取空腹（空腹10 h 以上）静脉采血，以贝克曼au5800生化分析仪检测肝肾功能、总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）及高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）；罗氏Cobas E602 全自动电化学发光分析仪检测空腹胰岛素、空腹C肽；糖化血红蛋白分析仪检测糖化血红蛋白，希森美康xn9000 全自动血液分析仪检测血常规（白细胞计数、中性粒细胞绝对值和淋巴细胞绝对值）。

1.3.2 流式细胞仪检测外周血Th1 和Th2 细胞 取肝素抗凝全血125 l，加入RPMI 1640 培养液125 l，1 l 佛波酯/离子霉素混合物（250×，杭州联科生物）和1 l 布雷非德菌素/莫能霉素混合物（250×，杭州联科生物），37 ℃孵育箱中培养4～6 h 后收集细胞。用人抗CD3（FITC，克隆号：OKT3，联科生物）和抗人CD8（PerCP-Cy5.5，克隆号：RPAT8，联科生物）进行细胞表面染色，分别加入抗人IFN-（PE，克隆号：4SB3，联科生物），抗人IL-4（APC克隆号：8D48，联科生物）进行细胞内因子染色。采用流式细胞仪检测分析，以CD4+IFN-+/CD4+T表示Th1 占CD4+T 细胞的比例，CD4+IL-4+/CD4+T 表示Th2 占CD4+T 细胞的比例。用Flow jo 软件分析数据。

1.3.3 胰岛素抵抗指数 稳态模型评估的胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）=空腹血糖×空腹胰岛素/22.5，稳态模型评估的胰岛 细胞功能指数（HOMA-）=20×空腹胰岛素/（空腹血糖－3.5）。

1.4 统计方法 采用SPSS 25.0 软件处理数据。正态分布的计量资料数据以均数±标准差表示，采用t 检验；非正态分布数据以M（P25，P75）表示，比较采用秩和检验；计数资料采用2检验；相关因素分析采用Spearman 相关性分析。P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组一般资料比较 两组身高、颈围、臀围、UA、TC、TG、LDL-C、白细胞计数、中性粒细胞计数和淋巴细胞计数差异均无统计学意义（均P ＞0.05）。观察组体质量、BMI、腰围、内脏脂肪面积、皮下脂肪面积、空腹血糖、空腹胰岛素、空腹C 肽、HOMA-IR 及糖化血红蛋白均高于对照组（均P＜0.05），HOMA-、HDL-C 均低于对照组（均P ＜0.05）。见表1。

表1 两组一般资料比较

2.2 两组外周血Th1、Th2 和Th1/Th2比值 与对照组相比，观察组Th1 在外周血CD4+T 淋巴细胞中的比例、Th1/Th2 比值均升高（均P ＜0.05），Th2 在CD4+T 淋巴细胞中的比例降低（P ＜0.05），见表2。

表2 两组Th1、Th2 和Th1/Th2 比较

2.3 外周血Th1、Th2 和Th1/Th2 与HOMA-IR、HOMA-和糖化血红蛋白的相关性分析 Spearman 分析显示，人体外周血Th1 与Th2 比例呈负相关（r=－0.358，P=0.023），Th2 比例与HOMA-呈正相关（r=0.391，P=0.013），Th1/Th2与 HOMA-呈负相关（r=－ 0.438，P=0.005），与 HOMA-IR呈正相关（r=0.322，P=0.043），与糖化血红蛋白呈正相关（r=0.349，P=0.027），见表3。

表3 Th1、Th2 和Th1/Th2 与HOMA-IR、HOMA-和糖化血红蛋白的相关性

3 讨论

2 型糖尿病的发病是一个复杂的病理过程，2 型糖尿病患者存在免疫异常及器官特异性抗体的改变。在2 型糖尿病发病机制的相关研究中发现脂肪组织中巨噬细胞浸润增加，相关炎性细胞因子表达上升，而Wu 等[4]及Kintscher 等[5]的研究结果分别证实了T淋巴细胞浸润早于巨噬细胞的出现。Nishimura 等[6]研究再次证实了T淋巴细胞在脂肪组织炎症的起始阶段即已介入，并且与该炎症所介导的糖耐量异常和胰岛素抵抗的进展变化一致。上述研究结果均提示了T 淋巴细胞在2 型糖尿病发病的上游启动和维持过程中发挥了重要的作用。

本研究纳入的2 型糖尿病均为初发患者，糖化血红蛋白均值为6.59%，BMI、腰围、内脏脂肪面积及HOMA-IR均比对照组明显升高，这说明在2 型糖尿病初发阶段胰岛素抵抗已经参与到发病过程中，而HOMA-也同时降低，提示在胰岛素抵抗的同时合并胰岛功能不足。分析其原因可能为增多的脂肪加重了慢性炎症，使胰岛素敏感性下降，刺激胰岛素抵抗发生，促使患者血糖升高，高血糖刺激机体分泌更多的胰岛素，加重了胰岛的负担，从而导致胰岛功能不足。庞邵杰等[7]研究结果也发现糖尿病患者胰岛素抵抗指数高于正常人群，并且在糖尿病前期已经出现了胰岛素抵抗。

本研究还发现2 型糖尿病患者较正常对照组Th1 升高、Th2 降低以及Th1/Th2 比值升高。研究显示，CD4+T 淋巴细胞亚群比例的平衡是维持免疫稳态的关键，其包括Thl 细胞和Th2 细胞，Th1淋巴细胞表现为促炎作用，Th2 淋巴细胞则为抗炎细胞，二者之间的比例平衡是维持免疫稳态基础[8-9]。本研究结果提示观察组促炎作用增强，抗炎作用减弱，并且出现促炎和抗炎细胞比例失衡，这与盛志新等[10]结果一致。

在相关分析方面，本研究发现人群中Th1 与Th2 呈负相关，支持目前的相关理论，即Th1 与Th2 作用互相拮抗。同时发现Th2 与胰岛 细胞功能指数成正相关，Th1/Th2 与胰岛素抵抗指数、糖化血红蛋白正相关，与胰岛 细胞功能指数负相关，这提示Th1/Th2的升高和Th2的下降可能参与了胰岛素抵抗加重和胰岛 细胞功能下降的过程，但是具体的机制还需要进一步的研究。而其他衡量肥胖的指标如BMI、腰围和内脏脂肪面积等均未发现与Th1 和Th2 有相关性，分析可能与纳入的2 型糖尿病患者患病时间不长，并且血糖不够高有关。