雌激素对SD 大鼠肾脏缺血再灌注肾小管上皮细胞Cx43 蛋白表达的影响

马义博， 常越辰， 马克涛， 李丽， 王勤章， 李应龙，3*

1.石河子大学医学院，新疆 石河子832000；2.石河子大学医学院第一附属医院泌尿外科，新疆 石河子832000；3.成都中医药大学附属第五人民医院泌尿外科，成都611130

临床上缺血-再灌注损伤（ischemic reperfusion injury，IRI）多见于冠心病、肾移植手术、肝移植手术等疾病或手术中。当血流中断或减少时会导致细胞缺血缺氧，进而引发组织或器官损伤，且缺血时产生的代谢物及介质会导致损伤加重，具体表现为细胞超微结构、功能、代谢及电生理方面发生进一步的损伤［1］。肾脏缺血再灌注（ischemia-reperfusion，I/R）在临床中多由心脏骤停（全身低灌注）及肾脏外科手术干预造成［2］。在肾脏移植手术中，肾脏损伤开始于供体器官取出后短暂的热缺血，然后在低温保存中进行长时间的冷缺血，最后在受体植入期间以热缺血结束。血运重建后，肾脏血流再灌注激活一系列事件会加重肾脏损伤［3］，进而导致肾脏出现血流动力学改变、炎症和肾小管上皮细胞损伤［4-5］。有研究发现，肾脏I/R 后肾小管上皮细胞胞膜离子进出功能障碍，细胞粘附能力减弱，最终导致肾小管上皮细胞凋亡［6］。缝隙连接（gap junctions，GJs）膜通道由连接蛋白（connexin，Cx）组成，为小分子和离子进出以及旁分泌信号传导提供管道，其中Cx43在肾脏组织中表达最为丰富［7-9］。当肾脏发生缺血再灌注损伤时，Cx43 通过多种作用参与细胞的损伤和凋亡［10］。有研究发现，抑制Cx43的表达可减少相邻细胞间活性氧（reactive oxygen species，ROS）通过，抑制氧化应激和炎症反应，减少坏死性凋亡，从而减轻肝移植后的急性肾脏损伤［11］。

雌激素是一种性激素，在人体中主要由卵巢产生，包括雌酮（estrone，E1）、17β-雌二醇（17β-estradiol，E2）和雌三醇（estriol，E3），但大多数的雌激素信号转导主要是由E2来完成的［12］。E2除了在可生育女性卵巢中产生外，在其他组织中可通过芳香化酶将睾酮转化为E2［13］，芳香化酶在不同的性腺外组织中均有表达，如脂肪、骨骼和大脑［14］。雌激素可明显减轻多个脏器的缺血再灌注损伤及脑海马细胞和肝细胞的凋亡［15−16］。此外，有研究发现，E2可调节心肌细胞、皮质骨和小梁骨中Cx43的表达，从而影响心肌细胞和骨细胞的凋亡［17-18］。

本课题组前期研究发现，雌激素受体激动剂对肾脏I/R 后肾小管上皮细胞凋亡起保护作用［19］，但对肾缺血再灌注损伤肾组织GJs 功能的影响尚不明确。基于此，本研究旨在探讨雌激素对肾脏I/R 的保护作用机制与肾小管上皮细胞中Cx43 表达水平的关系，以期为治疗肾脏I/R 探索新的途径。

1 材料与方法

1.1 实验动物

由新疆医科大学动物中心购入32 只SPF 级雌性SD 大鼠［许可证编号：SCXK（新）2018-0001］，周龄10～13 周，平均体质量250±30 g，本试验已通过石河子大学医学院动物管理与使用委员会批准（编号：A2019-170-01）。在清洁动物房标准化饲养雌性SD 大鼠，每笼4 只，保证垫料、食水充足，动物房温度24±2 ℃，湿度50%±5%。

1.2 实验试剂与仪器

雌激素（E2）购于美国Sigma 公司；兔抗Cx43购于美国Abcam 公司；大鼠抗β-actin、山羊抗兔抗体、山羊抗大鼠抗体购于北京中杉金桥公司；戊巴比妥钠购于上海生工生物有限公司；其他试剂均为国产分析纯。Cobas8000 全自动生化分析仪购于瑞士Roche公司；DYY-6D 型电泳仪购于北京六一生物科技公司；5920 R 低温高速离心机购于德国Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 雌性SD 大鼠去卵巢模型及肾脏缺血再灌注损伤模型的制备 32 只健康雌性SD 大鼠均在禁食禁水6 h 后，于左下腹外侧部注射3%戊巴比妥钠（50 mg·kg−1）进行麻醉，选择大鼠双侧背部外侧最凸起的位置做一手术切口切除双侧卵巢［20］。术后恢复14 d后，32只雌性SD大鼠随机分为OVX组、OVX+Sham 组、OVX+I/R 组和OVX+I/R+E2组，每组8只。OVX组不进行任何处理；OVX+Sham组行假手术处理：麻醉成功后沿双侧肋中线分别纵行切开，暴露双侧肾脏，并切除右肾，45 min后关闭腹腔；OVX+I/R组行缺血再灌注处理：麻醉成功后沿双侧肋中线分别纵行切开，暴露双侧肾脏，并切除右肾，剥离左肾蒂周围组织，使用无创动脉夹夹闭肾蒂中分离的左肾肾动脉，肾脏由鲜红变为暗红，持续缺血45 min 后，去除动脉夹，肾脏再次变为鲜红色后，关闭腹腔，恢复血流灌注24 h；OVX+I/R+E2组在行缺血再灌注处理前3 d连续进行雌激素干预处理：在OVX+I/R组基础上，于缺血再灌注损伤建立前经腹腔注射给予100 μg·kg−1·d−1雌激素进行干预，连续干预3 d，其他3组均给予等量溶剂（棉籽油）。

1.3.2 各组大鼠血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）和血肌酐（serum creatinine，SCr）检测 各组大鼠血流灌注24 h后，腹腔注射3%戊巴比妥钠进行麻醉，于主动脉采血，将采集的血液标本，于4 ℃4 000 r·min−1离心10 min，分离上清，送石河子大学医学院第一附属医院检验科，采用全自动生化分析仪检测各组大鼠血液标本BUN、SCr水平。

1.3.3 各组大鼠肾脏组织病理检查和Paller 评分比较 各组大鼠血流灌注24 h 后，腹腔注射3%戊巴比妥钠进行麻醉，取左侧肾脏行常规石蜡包埋，光镜下观察大鼠肾脏组织病理情况。采用Paller评分［21］评估肾小管损伤程度，所有切片光镜下观察均采用双盲法，由两名病理科主任医师阅片，两人结果一致则记录结果，如有争议请第3名病理科医生看片，以两名医生结果相同为最终结果。每张切片随机选择10 个含有肾小球的视野并进行评分。评分标准：肾小管结构正常计0分，肾小管管径增宽变形计1 分，管腔内有脱落坏死细胞（未成管型/细胞碎片）计1 分，上皮细胞形态改变计1 分，刷状缘损伤计1 分，刷状缘脱落计2分，有管型计2分［22］。

1.3.4 免疫组化检测Cx43 蛋白的表达 石蜡切片在67 ℃恒温箱烘烤2 h，二甲苯脱蜡后乙醇复水，抗原修复液修复抗原后用PBS 漂洗，加入Cx43 一抗（1∶200）4 ℃孵育过夜，次日复温45 min后，PBS漂洗，加入二抗（1∶200），室温孵育30 min，洗3 次，二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）染色后观察。

1.3.5 蛋白印迹法检测Cx43 蛋白表达 取冻存肾脏组织加入蛋白裂解液研磨提取蛋白，离心机4 ℃、12 000 r·min−1离心5 min，离心后分离上清，使用BCA 试剂盒测定蛋白浓度。各组取15 μg 进行凝胶电泳，转膜至PVDF 上，封闭2 h。TBST 漂洗3次，加入Cx43一抗（1∶1 000）4 ℃孵育过夜；次日TBST 漂洗3 次，加入Cx43 二抗（1∶10 000）孵育2 h，暗室中显色曝光，显影后定影。Image J 测定蛋白条带灰度值，以β-actin 蛋白为内参，并进行半定量分析。

1.4 统计学分析

采用SPSS 21.0软件对数据进行分析，计量资料采用平均值±标准差表示，比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 雌激素对肾脏I/R后肾功能的影响

如图1 所示，OVX 组与OVX+Sham 组SCr 和BUN 水平比较差异均无统计学意义（P＞0.05），说明手术对大鼠肾功能无明显影响；OVX+I/R 组SCr 和BUN 水平均显著高于OVX 组（P＜0.05），说明 肾 脏I/R 模 型 制 备 成 功；OVX+I/R+E2组SCr、BUN 水平均显著低于OVX+I/R 组（P＜0.05），说明雌激素可以减轻大鼠肾功能损伤。

图1 各组大鼠BUN和SCr水平比较Fig.1 Comparison of the levels of BUN and SCr among different groups of rats

2.2 雌激素对肾脏I/R 后肾实质及肾小管上皮细胞的影响

如图2 所示，光镜下观察HE 染色结果显示，OVX 组及OVX+Sham 组可见肾小管无扩张，内皮细胞排列整齐，无管型堆积。与OVX 组相比，OVX+I/R 组肾小球皱缩变形明显，部分肾小管管腔内刷状缘损伤脱落明显，结构改变，肾小管上皮细胞水肿及细胞核脱落明显；OVX+I/R+E2组肾小管扩张减轻，管型相对完整，肾小球皱缩及肾小管上皮细胞核脱落少于OVX+I/R 组。OVX 组与OVX+Sham 组Paller 评分比较差异无统计学意义（P＞0.05）；与OVX 组相比，OVX+I/R 组Paller 评分显著升高（P＜0.05）；OVX+I/R+E2组Paller 评分显著低于OVX+I/R组（P＜0.05）。结果表明假手术不会造成肾脏损伤，缺血再灌注对肾脏造成巨大损伤，雌激素干预后肾脏损伤明显减轻。

图2 各组大鼠肾组织病理改变和Paller评分比较Fig.2 Comparison of histopathological changes in kidney tissues and Paller scores among different groups of rats

2.3 Cx43 蛋白在大鼠肾小管上皮细胞中的表达分析

如图3 所示，免疫组化结果表明，肾小管上皮细胞中Cx43 蛋白主要分布于细胞胞浆中。OVX组与OVX+Sham 组Cx43 蛋白阳性表达比较差异无统计学意义（P＞0.05）；与OVX组相比，OVX+I/R组Cx43 蛋白阳性表达显著增加（P＜0.05）；与OVX+I/R 组 相 比，OVX+I/R+E2组Cx43 蛋 白 阳 性表达显著减少（P＜0.05）。结果表明假手术不会影响肾小管上皮细胞Cx43的表达，肾脏缺血再灌注后肾小管上皮细胞Cx43的表达明显增加，雌激素干预后肾小管上皮细胞Cx43表达减少。

图3 Cx43在各组大鼠肾小管上皮细胞中的表达Fig.3 The expression of Cx43 in renal tubular epithelial cells among different groups of rats

3 讨论

泌尿外科手术中常需要阻断肾脏血供，而血运重建后会加重肾脏损伤，这种病理现象被称为肾脏I/R［23］。肾脏I/R 可引起急性肾损伤，导致BUN、SCr 水平升高［24］，最终导致肾脏功能障碍，但目前尚缺乏有效的治疗方法［25-26］。本课题组前期研究发现，通过激活雌激素受体可抑制肾脏I/R后产生的氧化应激反应［27］，并抑制肾小管上皮细胞的凋亡［19］。有研究为避免雌性大鼠自身产生雌激素对实验的影响，对雌性大鼠实施了切除双侧卵巢处理［28-29］，结果表明，在去卵巢2 周后E2水平明显降低。本研究结果表明，与OVX 组相比，OVX+I/R 组大鼠SCr、BUN 水平和Paller 评分均显著升高（P＜0.05），提示肾功能及肾小管上皮细胞有明显损伤；与OVX+I/R 组相比，OVX+I/R+E2组SCr、BUN水平和Paller评分显著降低，肾组织病理学改变及Paller评分结果显示，雌激素干预后肾小管管型结构受损减轻，管状缘、刷状缘脱落减少，肾小管上皮细胞核脱落减少，Paller 评分降低，说明肾功能得到了改善，与前人研究结果一致［27-19］。

缝隙连接介导分子和电荷的细胞间转移［30］，是多数器官功能障碍的生物学基础。因此，探讨雌激素抑制肾小管上皮细胞凋亡相关的机制具有重要意义。缝隙连接细胞间通讯对于细胞分化和生长、正常生理以及不同组织中氧化应激和炎症反应的调节至关重要［31］。相关研究［32］表明，在心肌缺血再灌注损伤中可通过抑制Cx43 从而减少心肌缺血后的梗死面积，此外，在脑缺血再灌注损伤中星形细胞Cx43 在神经炎症反应中起关键作用［33］。Cx43 缝隙连接蛋白在成骨细胞中也充分表达，在骨重塑及成骨细胞活动中发挥重要作用。当雌激素水平降低时，成骨细胞Cx43半通道活性降低，进而导致成骨细胞对氧化应激抵抗力下降［34］。另外在成骨细胞中雌激素可以通过Cx43介导的缝隙连接信号通路MC3T3-E1 调节成骨样细胞的增殖及分化，促进细胞外基质矿化［35］。在心血管疾病中，雌激素可通过降低淋巴细胞中Cx40/Cx43 的表达，以减轻高血压的炎症和终末器官损伤［36］；同时，雌激素还可通过抑制淋巴细胞白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和IL-6释放并下调Cx40 水平［37］。雌激素的生理效应由经典的雌激素受体ERa和ERb以及G蛋白偶联雌激 素 受 体（G protein-coupled estrogen receptor，GPER）介导［38-39］。雌激素与雌激素受体结合导致构象变化，促进受体二聚化并转移至细胞核，在细胞核中识别目标基因启动子区域的不同DNA 序列［40-41］。ERα 和ERβ 在小鼠和大鼠的肾脏中均有表达［42-43］，但二者主要定位于小鼠肾近端小管，较少定位于远端肾单位［42］。雌激素和ER 在肾脏的多种病理过程中发挥重要作用，雌激素通过其受体参与肾脏修复和再生，改变或失调的雌激素/ERs 信号通路可能导致多种肾脏疾病，包括急性肾损伤、糖尿病肾病、狼疮肾炎、IgA 肾病等。临床研究表明，靶向雌激素/ERs 信号通路可能对某些肾脏疾病具有保护作用［44］。Kurtz 等［45］在肾血管系统、系膜细胞以及集合管中发现Cx43广泛存在。Wagner等［46］研究表明，Cx在肾循环中具有重要意义。Cx43被认为是表达最广泛的Cx，并认为其在肾脏疾病中扮演重要角色［7］。GJs 介导不同器官中细胞信号分子的细胞间运动，其是导致器官进一步损伤的生物学基础，且通常与Cx43通道介导的不同类型的信号传递有关，如“死亡信号”和“保护信号”［47］。Hver-garae 等［48］发现抑制Cx43有利于肾脏保护，主要是通过减少“死亡信号”的传递实现的，原因为在肾脏I/R 过程中，可能导致大量“死亡信号”的产生，并增加肾脏中Cx43的表达。“死亡信号”通过由Cx43 组成的GJs 持续传递到邻近细胞，导致损伤范围扩大和恶化。因此，减少GJs 介导的“死亡信号”向邻近细胞的扩散，可在一定程度上保护细胞，并防止损伤不断恶化和扩大［11］，这可能是一种预防肾脏I/R 的新途径。本研究中免疫组化和蛋白印迹结果表明，与OVX组相比，OVX+I/R 组Cx43 表达明显升高，说明肾脏功能及肾小管上皮细胞损伤与Cx43 蛋白表达增加有关；与OVX+I/R 组相比，OVX+I/R+E2组肾小管上皮细胞中Cx43蛋白表达明显减少，表明雌激素可以减轻肾脏缺血再灌注损伤造成的肾脏损伤，可能是通过调节肾小管上皮细胞中Cx43表达实现的。

综上所述，雌激素可能通过减少肾小管上皮细胞中Cx43 蛋白的表达来减轻肾脏缺血再灌注后的肾损伤，说明雌激素对肾脏缺血再灌注具有保护作用，但本研究未对这一过程的直接途径及信号传导进行分析，未来还需进行更深入的研究以阐明具体机制，为临床治疗肾脏缺血再灌注后肾损伤提供新思路。