PRNs基因家族研究进展

樊锦瑞， 王磊， 邹俊杰

中国农业科学院生物技术研究所，北京100081

Pirin（PRN、PIR）蛋白在人类中最初是通过酵母双杂交筛选发现的，其与转录因子NFI/CTF1（nuclear factor I/CCAAT box transcription factor）相互作用，发挥相关功能［1］。已有报道表明，人hPRN 可作为转录因子辅因子和氧化还原感受器，参与多个生物学过程，与癌症的发生密切相关［2］。除了人类，在其他哺乳动物、植物、真菌甚至原核生物中也都存在PRN 同源蛋白，PRN 蛋白的N 端蛋白结构高度保守［1，3-5］。本文总结了PRN蛋白的基本结构和生化特征，重点综述了不同物种的PRN 蛋白生物学功能研究进展，并对植物PRN 蛋白今后的研究进行了展望，以期为癌症治疗和作物改良提供新的靶点。

1 PRNs的结构

PRNs 在哺乳动物、植物、真菌和原核生物中高度保守，根据序列和结构相似性被归类为Cupin 超家族的一个亚家族。Cupin 来源于拉丁文“cupa”，在拉丁语中是指木桶或小桶的意思，因此，将具有β 折叠片围成的桶状结构的蛋白命名为Cupin［6］。Cupin 家族蛋白除具有保守的β-barrel 结构外，还有两个保守的基序（motif），即［G（X）5HXH（X）3，4E（X）6G］和［G（X）5PXG（X）2H（X）3N］，两个基序由15~50 个氨基酸隔开，形成了与金属离子结合的区域，被保护在β 桶状结构中［7-9］。

Winaker 等［1］首次克隆了人类hPRN基因，对hPRN基因的表达、蛋白结构和亚细胞定位进行了分析。如图1所示，hPRN 蛋白的晶体结构含有两个不同的Cupin 家族基序：一个是β-桶状折叠区域，在其N 端区域，含有金属离子结合位点，由3个组氨酸和1个谷氨酸组成；另一个是含α-螺旋的C-末端结构域，该结构域不含金属结合位点，也不含保守的金属配位残基。C-末端的α-螺旋结构并不是在所有物种中都保守，如大肠杆菌中就缺失了这段保守序列［4，10］。

PRN蛋白的晶体结构与槲皮素2，3-双加氧酶结构相似，具有类似槲皮素酶的功能，能够降解槲皮素。槲皮素是一种类黄酮物质，具有抗氧化、预防癌症、DNA 防护、抗炎反应和保护心脏等作用［11］。PRN与槲皮素2，3-双加氧酶均是利用槲皮素作为底物，酶促反应过程中均释放一氧化碳，且槲皮素2，3-双加氧酶抑制剂还能抑制PRN 活性，表明PRN蛋白具有类似槲皮素酶的活性［4］。

不同物种PRNs 结合不同金属离子的能力存在差异，与其功能密切相关。研究发现，PRN 可以结合Fe2+、Fe3+、Cu2+、Ni2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+等不同金属离子［9，12］。hPRN结合的最适金属离子是Fe2+/Fe3+，大肠杆菌YhhW 为Ni2+，假单胞菌pirin-like为Cu2+［9，12］。这些物种中，PRN 与最适金属离子结合后，可以增强其槲皮素酶的活力。保守的金属离子结合域表明，PRN 可能通过结合不同金属离子来改变蛋白酶活性，也可通过结合不同价态的离子来参与基因表达调控。

2 不同物种PRNs进化关系

与哺乳动物、微生物仅有1个PRN 成员不同，不同植物的PRNs 均包含1 个小基因家族（图2），其中拟南芥中有4 个成员，水稻有3 个成员，玉米有4个成员，推测植物的PRNs可能具有更丰富的功能。同时，同一家族中的成员并未形成一个基因簇，而是分散在同一染色体的不同部位，或位于不同染色体上，暗示同一物种PRNs 可能具有不同的表达调控模式；一些同种家族成员也并未分布在同一进化分支中，进化距离较远，可能发挥不同的生物学功能。水稻的3 个成员在进化关系上分布于3 个不同的分支。拟南芥4 个成员中，AtPRN1、AtPRN2 和AtPRN3 进 化 关 系 更 近，而AtPRN4 被聚集到另一组（图1）。大量研究报道AtPRN1 和AtPRN2 具有不同的生物学功能［3，13-18］，不同植物PRNs生物学功能仍有待进一步研究。

图1 部分植物PRN蛋白系统发育树[13]Fig.1 Phylogenetic tree of parts of plant PRN proteins[13]

3 PRN蛋白的生物学功能

自1997年PRN蛋白首次被发现以来，PRN的相关研究持续开展，PRNs在人、微生物、植物等不同物种中的生物学功能见表1。

表1 PRN蛋白在不同物种中的生物学功能Table 1 Biological functions of PRN proteins in different species

3.1 PRN在人体中的生物学功能

hPRN 是一个32 kD 的蛋白质，由290 个氨基酸组成，定位于细胞核并呈点状分布［1］。hPRN 蛋白在人体中的研究较为广泛，在人体正常组织中表达水平相对较低，癌症发生过程中其表达量或定位发生变化。在急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）中hPRN的 表 达 下 调，hPRN是终末期髓细胞成熟必须的，其下调可能与AML 相关的分化受阻有关［26］。hPRN在大部分癌症中受到诱导会上调表达，与癌症发生密切相关。香烟刺激气道上皮细胞hPRN表达增加，转录因子Nrf2 能够结合hPRN的启动子区域的AREs 元件，调控hPRN的表达，参与上皮细胞凋亡和口腔癌的过程［19-20］。HPV16 E7 癌蛋白可以促进hPRN上调，导致上皮-间质转化（epithelialmesenchymal transition，EMT）和细胞迁移增加，从而引起口腔肿瘤细胞中hPRN/NF-κB 的活化［35］。在黑色素瘤细胞中，hPRN高表达，可抑制细胞衰老。黑色素瘤细胞中hPRN 亚细胞定位发生由细胞核向细胞质转移，细胞质hPRN 的水平与黑色素瘤的进展密切相关［26，36］。

hPRN 蛋白具有槲皮素酶的功能，同样参与了疾病的进展过程。在人体中高表达hPRN降低了体内槲皮素的含量，进而降低了槲皮素对脊髓灰质炎病毒的抑制作用，而siRNA 诱导hPRN水平的下降，使该病毒复制时对黄酮类化合物更加敏感［37］。

hPRN 可作为转录因子辅因子发挥功能，参与调控基因的转录。hPRN 能够与诱导凋亡的转录因子NF-κB（p50）相互作用，与原癌蛋白Bcl3形成复合物，抑制hPRN 与Bcl3 的结合，降低转录因子SNAI2表达和黑色素瘤细胞移动［22］。NF-κB 是一种普遍存在的转录调节因子，被认为在免疫反应、细胞凋亡、炎症和氧化应激中起重要作用［38-39］。在氧化条件下，hPRN 的结构从Fe2+（非活性形式）转变为Fe3+（活性形式），可改变蛋白R-shape 构象，氧化态的hPRN-Fe3+可促进p65 与DNA 分子的结合［2，29-30］，说明hPRN 可作为氧化还原感受器（redox sensor），感受体内氧化还原变化，参与基因转录的调控。另外，hPRN 也能通过直接结合细胞周期激活因子E2F1启动子区域，激活E2F1的转录，进一步调控E2F1 的靶基因cdk4、cdk6、cycD、cycE和DDR1的表达，促进乳腺癌细胞G1期到S期的转变［25］。

hPRN 主要通过以下两个方面发挥其生物学功能：一是具有槲皮素酶的功能，参与调节体内槲皮素水平；二是可以作为转录因子辅因子，通过调控转录因子的活性，参与基因表达调控，以及癌症的发生和增殖过程。研究表明，降低hPRN的表达水平，有助于治疗癌症，如宫颈癌发生过程中hPRN 通过降低上皮细胞钙粘附蛋白（E-cadherin）的表达而诱导EMT；敲除hPRN基因可提高E-cadherin 水平，降低宫颈癌细胞中粘附素、锌指蛋白ZeB和锌指转录因子Snail的转录水平［40］。而在黑色素瘤细胞中，利用小分子抑制剂TphA可以阻断hPRN 和BCL-3之间的相互作用，最终抑制黑色素瘤细胞的迁移［22］。此外，降低hPRN的水平后发现，转移性黑色素瘤细胞的形态和大小均发生了改变，呈现出衰老的表型［23］。乳腺癌中，hPRN的敲除显著降低了乳腺癌细胞的增殖率，并降低了小鼠异种移植瘤的生长［25］。以上研究表明，hPRN可能成为一个重要的潜在生物标志物或治疗靶点。

3.2 PRN在微生物中的生物学功能

细菌PRNs 同样具有槲皮素酶活性，并且可以与不同金属离子结合改变其活性。斯氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）的pirin-like通过大肠杆菌中异源表达，在二价金属离子的作用下表现出槲皮素酶活性，并且在Cu2+的情况下表现出最高的活性［12］。而大肠杆菌中的PRN 同源蛋白YhhW也具有降解槲皮素的酶活性，其被鉴定为一个新的含镍双加氧酶成员。此外，在催化腔附近有一个灵活的“Ω 环”，这可能有助于通过镍-黄酮醇络合物稳定反应中间产物［9］。

另外，原核生物PRNs 也参与逆境和氧化胁迫等过程。在原核生物中，蓝藻prnA的表达受到高盐、山梨醇、乙醇和甲基紫精处理诱导增加，而不受高低温和强光诱导［33］。沙雷氏菌（Serratia marcescens）pirinSm与丙酮酸脱氢酶E1亚基相互作用，通过调节丙酮酸脱氢酶活性来调节丙酮酸分解代谢，参与丙酮酸代谢向三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle，TCA 循环）或发酵途径的过程［31］。链霉菌（Streptomyces ambofaciens）中PirA 对中枢碳代谢和能量代谢基因的表达有显著影响，pirA突变体表现为对氧化损伤和聚酮化合物抗生素产生的抑制高度敏感，其突变体负调控长链乙酰辅酶，可催化β-氧化途径的第一步［32］。

3.3 PRN在植物中的生物学功能

拟南芥的PRNs 影响种子萌发、木质素积累和器官发育等过程。拟南芥AtPRN1定位于细胞质和细胞核，其表达受脱落酸（abscisic acid，ABA）和红光诱导增加，能够与G 蛋白的α 亚基GPA1 互作，位于GPA1 的下游。AtPRN1突变体发芽率降低，脱落酸处理下发芽和早期幼苗发育延迟，参与了种子萌发和早期的幼苗生长［3］。研究表明AtPRN1 是一种穿梭蛋白，在感受信号后进入细胞核与转录因子NF-Y 结合，G 蛋白偶联受体GCR1、GPA1、AtPRN1和NF-Y 形成信号通路介导蓝光和ABA 响应，影响种子萌发［14］。AtPRN2定位于细胞质和细胞核，主要在维管束附近的细胞中表达。通过调节木质素生物合成基因的表达抑制了木质部导管附近S 型木质素的积累［13］。另外，寄生植物利用寄主根提供的特定分子来启动吸器的发育，吸器是植物寄生的关键入侵结构。TvPRN在寄生植物杂色三叶草（Triphysaria versicolor）的根中受到吸器诱导分子2，6-二甲氧基苯醌（2，6-dimethoxybenzoquinone，DMBQ）的诱导后表达上调，说明TvPRN与吸器发育相关，可能在寄生植物的寄主因子识别中发挥作用［41］。

AtPRNs家族成员具有槲皮素酶的功能，其中AtPRN1能够分解槲皮素，且其槲皮素酶活性受到其互作蛋白GPA1 影响，AtPRN1的突变体prn1中槲皮素含量增加。AtPRN1启动子区域存在可能与ABA 和激素信号有关的顺式作用元件，影响光或激素导向的早期发育［16］。说明AtPRN1 的槲皮素酶活性和转录辅因子活性相关，并共同参与拟南芥多个生物学过程。同时，AtPRNs还参与植物防御过程。AtPRN1影响真菌条件下种子的萌发过程，突变体对不同真菌敏感性存在差异［15］。拟南芥AtPRN2参与抗病反应，其突变体降低了侵染的发展和细菌的生长，表现出对维管束植物病原菌青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）的抗病反应。细胞质中AtPRN2 通过稳定半胱氨酸蛋白酶XCP2，抑制XCP2 自噬，增加对青枯雷尔氏菌的敏感性［18］。番茄Le-PRN的表达与细胞死亡密切相关，表达量随着细胞衰老和死亡显著升高，这为研究PNN 在植物防御机制中的作用提供了新的线索［34］。

4 展望

最初鉴定的hPRN被认为定位于细胞核，后来研究证明hPRN也可定位于细胞质中，且其发挥作用的潜在分子机制通常被认为是与核蛋白的相互作用［1，23］。拟南芥中PRNs 也存在穿梭入核的现象［14］，因此植物的PRNs 蛋白可能与hPRN 蛋白类似，在细胞核中也起到转录协同调节的作用。另外，根据亚细胞定位预测，玉米和水稻PRNs 部分成员具有线粒体和叶绿体定位肽（http：//cello.life.nctu.edu.tw/），这些细胞器是活性氧产生的重要场所，同时也是植物生长发育的关键［42］。根据系统发育树中同种植物基因家族间距离较远的进化关系［5］，推测植物中不同的PRNs 可能发挥不同的功能。同时拟南芥AtPRN1具有槲皮素酶活性，可改变植物体内槲皮素含量［16］。与细胞核的定位相结合，槲皮素酶活性和转录辅因子活性可能存在相关性，参与多个生物学过程。此外，槲皮素含量改变可能影响植物体内活性氧的水平，进而影响代谢、激素水平和抗逆，暗示植物PRNs 可能参与植物生长发育和抗逆过程，在抗逆品种培育方面具有一定的潜力。

目前植物PRNs 在调节重要的生物学功能的分子机制和功能多样性仍未明确。hPRN 可作为药物靶点，用于开展癌症治疗［43］。植物中是否存在类似hPRN 的氧化还原反应感应机制，以及是否在逆境胁迫调控中发挥重要作用还有待于进一步研究。未来可通过进一步阐明植物PRNs 功能及其调控机制，为作物分子设计育种提供新的靶点。