人参皂苷Rg1 对阿尔茨海默症大鼠BDNF-TrkB 信号通路的影响

陈晓光， 潘晓峰， 王帆， 潘宋斌*

1.武汉市第一医院（武汉市中西医结合医院）神经内科，武汉430022；2.武汉市第一医院（武汉市中西医结合医院）老年病科，武汉430022

阿尔茨海默症（Alzheimer's disease，AD）是老年人群中的常见疾病，又称老年痴呆，临床表现为记忆能力减退并伴随反应迟钝、理解能力下降等［1］。目前，AD 的发病机制尚未完全明确，临床仍缺乏疗效确切的治疗方法及药物。人参皂苷Rg1 是人参的有效成分，具有保护神经功能、抗衰老等作用，其也是AD 领域研究最多、最具代表性的成分之一［2-3］。脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）是中枢神经系统中的神经营养因子，可与酪氨酸激酶受体B（tyrosine kinase receptor B，TrkB）结合，调控神经元的生长、分化及突触的形成等过程［4］。近年来，多项研究表明，激活BDNF-TrkB 信号通路将有助于改善AD［5-6］。但目前关于Rg1改善AD的分子机制尚未统一，本研究旨在从BDNF-TrkB 信号通路的角度，分析人参皂苷Rg1对AD大鼠模型的保护机制，以期为人参皂苷Rg1用于治疗AD奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物 选取75 只雄性SPF 级6 周龄SD 大鼠作为研究对象，平均体质量为250±30 g，均购自西安交通大学医学部动物实验中心，许可证号：SYXK（陕）2018-001。本试验经动物伦理委员会审核批准且严格遵循动物试验减少（reduction）、优化（refinement）和替代（replacement）-3R原则。

1.1.2 药物与试剂 Aβ1-42 试剂购自美国SIGMA 公司；人参皂苷Rg1（货号：GD-GSJ125-585；纯度＞98%）购自逊希公司；乙酰胆碱（acetylcholine，Ach）试 剂 盒、5-羟 色 胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）试剂盒、乙酰胆碱酯酶（total cholinesterase，TChE）试剂盒均购自江莱生物有限公司；TUNEL染色试剂盒购自瑞士Roche 公司；切割后半胱氨酸蛋白酶-3（Cleaved Caspase-3）抗体（货号：sc-9661）、B 淋巴细胞瘤-2 抗体（B lymphocytoma-2，Bcl-2，货号：sc-15071）、Bcl-2 相关蛋白X 抗体（Bcl-2 associated protein X，Bax，货号：sc-5023），脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF，抗体货号：sc-65514）、酪氨酸激酶B抗 体（tyrosine kinase receptor B，TrkB，货 号：sc-8058）购自美国Santa Cruz 公司；HRP 羊抗兔IgG、HRP羊抗鼠IgG等二抗购自美国Thermo公司。

1.1.3 仪器 SMZ800 光学显微镜购自日本Nikon 公司；离心机购自德国Eppendorf 公司；垂直电泳槽、电泳仪及相关配件均购自美国Bio-Rad 公司。

1.2 方法

1.2.1 分组 75 只雄性SD 大鼠采用随机数字表法分为空白对照组、模型组、低剂量Rg1 组、中剂量Rg1组及高剂量Rg1组，每组15只。

1.2.2 脑片制作、模型建立[7]及给药处理 使用150 mmol·L−1NaCl，2 mmol·L−1CaCl2，1.2 mmol·L−1MgSO4，0.5 mmol·L−1KH2PO4配制人工脑脊液，另配制加入1 mmol·L−1Aβ1-42 试剂作为人工脑脊液诱导AD 模型，0 ℃保存备用。活体大鼠处死后立即取大脑切成厚度为400 μm的切片，挑选形态较好（含有海马和皮层组织）的脑片放入人工脑脊液中，培养温度32 ℃左右，氧气含量为95%，二氧化碳含量为5%。除空白对照组外各组加入含有Aβ1-42 试剂的人工脑脊液制备AD 模型，作用2 h后，低剂量Rg1 组、中剂量Rg1 组及高剂量Rg1 组分别加入60、120、240 μmol·L−1Rg1处理3 h，空白对照组和模型组加入等量0.9% NaCl 溶液，上述过程均在32 ℃、95%氧气、5%二氧化氮培养条件下进行。

1.2.3 HE染色 干预结束后取各组脑片，转移至4%多聚甲醛溶液中固定3 h，再放至30%蔗糖溶液中浸糖至沉底，制备组织冰冻切片，常规HE 染色，光镜下观察大鼠脑组织病理形态变化。

1.2.4 TUNEL 染色 干预结束后取各组脑片，参照上述方法制备组织冰冻切片，滴加3%过氧化氢溶液灭活内源性辣根过氧化物酶10 min，再加入蛋白酶K 37 ℃下消化15 min，加20 μL 标记缓冲液，再分别加入末端脱氧核苷酰转移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT）和荧光素标记的三磷酸脱氧尿甘（2'-deoxyuridine 5'-triphosphated，UTP）溶液各1 μL，37 ℃下反应2 h，然后加50 μL 封闭液，室温下静置30 min，滴加50 μL抗光抗体，室温下孵育40 min，再加入抗体稀释液1∶100 倍稀释的链霉亲和素-生物复合物（streptavidin-biotin complex，SABC），37 ℃下反应1 h，二氨基联苯胺（3，3′-diaminobenzidine，DAB）显色后，苏木素复染，光镜下观察大鼠脑组织细胞凋亡情况，黄褐色为凋亡细胞阳性染色。

1.2.5 Ach、5-HT含量和TChE 活力检测 取上述脑片，采用相关试剂盒检测大鼠脑组织Ach、5-HT含量和TChE 活力，检测方法严格按照试剂盒说明书进行。

1.2.6 蛋白质印迹检测蛋白表达水平 取上述脑片，提取总蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，并将蛋白转移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluorids，PVDF）上，加入脱脂奶粉，在37 ℃的条件下封闭2 h，后加入稀释后的Cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax、BDNF及TrkB蛋白抗体（稀释比例为1∶1 500），内参蛋白为GAPDH（稀释比例1∶1 000），4 ℃下孵育过夜，次日洗膜后加入HRP 羊抗兔IgG、HRP 羊抗鼠IgG 二抗（稀释比例1∶5 000），采用显色液显色后进行灰度值检测。蛋白相对表达量计算公式见式（1）。

蛋白相对表达量=目的蛋白灰度值/GADPH灰度值 （1）

1.3 统计分析

采用SPSS 22.0 软件进行数据分析，采用GraphPad Prism5 进行绘图，多组间比较使用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD 法，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 大鼠脑片HE染色结果

如图1 所示，HE 染色观察大鼠脑组织病理形态变化，空白对照组未见异常，海马神经元细胞结构完整；模型组海马CA1 区细胞排列松散，损伤明显；低剂量Rg1 组、中剂量Rg1 组及高剂量Rg1组脑组织病理损伤较模型组症状明显减轻。

图1 大鼠脑片HE染色结果Fig.1 HE staining results of brain slices in rats

2.2 大鼠脑片TUNEL染色结果

如图2 所示，TUNEL 染色观察大鼠海马CA1区细胞凋亡情况，空白对照组、模型组、低剂量Rg1 组、中剂量Rg1 组及高剂量Rg1 组脑组织细胞 凋 亡 数 分 别 为（7.21±2.15）、（58.27±11.24）、（42.31±8.56）、（29.64±6.34）、（15.68±3.32）个。与空白对照组比较，模型组脑组织细胞凋亡数显著增加（P＜0.05）；与模型组比较，低剂量Rg1 组、中剂量Rg1 组及高剂量Rg1 组脑组织细胞凋亡数显著减少（P＜0.05），且具有剂量依赖性。

图2 大鼠脑片TUNEL染色结果Fig.2 TUNEL staining results of brain slices in rats

2.3 大鼠脑片中凋亡相关蛋白检测结果

检测大鼠脑片中凋亡相关蛋白发现，与空白对照组相比，模型组大鼠Cleaved Caspase-3/GAPDH和Bax/Bcl-2水平显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，低剂量Rg1 组、中剂量Rg1 组及高剂量Rg1组Cleaved Caspase-3/GAPDH 和Bax/Bcl-2 水平显著降低（P＜0.05），且具有剂量依赖性（图3、表1）。

表1 大鼠脑片中凋亡相关蛋白检测结果Table 1 Detection results of apoptosis-related proteins in brain slices of rats

图3 大鼠脑片中凋亡相关蛋白检测结果Fig.3 Detection results of apoptosis related proteins in rat brain slices

2.4 大鼠脑片中5-HT、Ach 含量和TChE 活力检测结果

检测大鼠脑片中5-HT、Ach含量和TChE水平发现，与空白对照组相比，模型组大鼠5-HT 和Ach水平显著降低，TChE水平显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，低剂量Rg1 组、中剂量Rg1 组及高剂量Rg1组5-HT和Ach水平均显著升高，TChE水平 均 显 著 降 低（P＜0.05），且 具 有 剂 量 依 赖性（表2）。

表2 大鼠脑片中5-HT、Ach含量和TChE活力检测结果（x±s）Table 2 Detection results of 5-HT,Ach levels and TChE activity in brain slices of rats(x±s)

2.5 大鼠脑片中BDNF-TrkB 信号通路相关蛋白检测结果

检测大鼠脑片中BDNF-TrkB 信号通路相关蛋白发现，与空白对照组相比，模型组BDNF 和TrkB 蛋白表达量均显著降低（P＜0.05）；与模型组相比，低剂量Rg1 组、中剂量Rg1 组及高剂量Rg1 组BDNF 和TrkB 蛋白表达量均显著升高（P＜0.05），且具有剂量依赖性（图4、表3）。

图4 大鼠脑片中BDNF-TrkB信号通路相关蛋白检测结果Fig.4 Detection results of BDNF-TrkB signal pathway related proteins in rat brain slices

表3 大鼠脑片中BDNF-TrkB信号通路相关蛋白检测结果（x±s）Table 3 Detection results of BDNF-TrkB signaling path ways related proteins in brain slices of rats(x±s)

3 讨论

AD 的主要病理特征为多种因素诱导神经细胞凋亡［8］。细胞凋亡可引起AD 脑内皮质皱缩，基底前脑胆碱能神经元的减少及海马胆碱能纤维和突触的丢失，会导致记忆认知障碍［9］。本研究病理观察显示，采用Aβ1-42 培育后，大鼠脑组织损伤明显，且存在大量的凋亡细胞，促凋亡蛋白Cleaved Caspase-3 表达明显升高，Bax/Bcl-2 平衡也偏向促凋亡（Bax）水平，经不同剂量人参皂苷Rg1 处理后，脑组织损伤表现出不同程度的减轻，凋亡细胞也明显减少，Cleaved Caspase-3 和Bax/Bcl-2 水平明显降低，表明人参皂苷Rg1 可抑制脑组织细胞凋亡，从而发挥保护AD 的作用。许彤等［10］研究也显示，人参皂苷Rg1 可抑制过氧化氢诱导的海马神经元凋亡。

Ach 是与学习和记忆密切相关的神经递质，主要由突触前膜释放，与突触后膜上乙酰胆碱受体结合开放离子通道，引起神经元兴奋的传递［11］。胆碱被激活后可以易化由齿状回成熟神经元形成的长时程增强效应［12］。5-HT 也是中枢神经系统的重要神经递质，主要参与学习与记忆［13］。TChE是生物神经传导中的一种关键性酶，其可以降解乙酰胆碱终止神经递质对突触后膜的兴奋，保持神经间信号正常传递［14］。本研究发现，与模型组相比，使用人参皂苷Rg1 各组5-HT、Ach水平显著升高，TChE水平显著降低。表明人参皂苷Rg1 可以有效改善神经元功能。Liu 等［15］研究表明，人参皂苷Rg1 可以有效改善神经元Ach、5-HT的表达情况，与本研究结果一致。

目前关于Rg1改善AD的分子机制研究较多，据报道，Rg1可通过MAPK/ERK、PI3K/Akt和PKA/CREB 等信号通路改善AD 症状［16］，说明Rg1 对人体的作用可能是多途径、多方式和多靶点的。BDNF 是一种神经营养因子，主要在中枢神经系统中表达，具有神经保护功能［17］。据报道，提高海马体内的BDNF 水平，可以有效促进新突触形成并显著提高学习和记忆能力［18］。TrkB是BDNF 的特异性受体，BDNF可以与细胞膜上的TrkB结合，激活细胞内BDNF-TrkB 信号通路，通过调节钙离子对神经的生长和发育发挥促进作用，同时TrkB可以参与调节谷氨酸和γ-氨基丁酸突触后神经递质受体的数量和分布，从而调节突触可塑性，显著改善学习和记忆能力［19-20］。本研究发现，人参皂苷Rg1 处理后可有效逆转AD 导致的BDNF 和TrkB蛋白表达降低。说明人参皂苷Rg1可以通过激活BDNF-TrkB 信号通路，调节神经递质受体的数量和分布，改善神经受损后突触可塑性，加快大鼠神经功能的恢复。

综上所述，人参皂苷Rg1可有效保护AD模型大鼠脑组织损伤，抑制神经细胞凋亡，其作用机制可能与激活BDNF-TrkB信号通路相关。