分子生物实验室室内质量控制失控原因分析

宋然，孟芹

1.湖南省郴州市第一人民医院检验医学中心，湖南郴州 423000；2.感染性疾病及肿瘤基因诊断技术国家地方联合工程研究中心，湖南长沙 410000

近年来，以核酸检测为代表的分子生物学技术取得了长足的进步并在临床广泛开展。 由于其具有灵敏度高、特异性强，可缩短检测窗口期并可检测病毒变异等特点，成为临床病原体感染诊断的主要手段[1]。 收集样本、提取核酸，扩增核酸，检测产品与结果报告及解释等均属于临床分子生物实验室中的基本操作。室内质控是分子生物实验室质量的关键部分，为保证每个标本检测结果的准确性、可靠性，做好质控是每个分子生物实验室日常工作的核心之一，实验室在标本检测前，要确保室内质控在控，当仪器出现项目失控的情况，必须立刻查找失控的原因并进行及时纠正，才能确保当天各项核酸检测结果的准确性[2-3]。而室内质量控制即实验室工作人员采取一定的方法和步骤，连续评价该实验室工作的可靠性程度，旨在监测和控制本室常规工作的精密度，提高本室常规工作中批内、批间样本检验的一致性，以确定测定结果是否可靠、可否发出报告的过程[4]。室内质量控制范围覆盖上述顺序中的样本处理、核酸扩增和产物检测步骤[5]。 施行有效的室内质量控制措施是保证核酸检测结果准确性和及时性的有效手段。该文通过统计该实验室2019年1月—2021年9月HBV DNA、HCV RNA检测项目的室内质控失控数据及纠正措施，探讨分子生物实验室核酸检测项目的室内质控关键点。 现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

核酸扩增仪为Thermofisher，ABI 7500 扩增仪；该仪器由扩增检测系统（半导体PCR 仪、卤钨灯光源、五色滤镜轮和冷CCD 照相机进行荧光检测）、应用软件及配套电脑组成[5]。 试剂为圣湘生物科技股份有限公司的乙型肝炎病毒核酸测定试剂盒、 丙型肝炎核酸检测试剂盒。使用核酸检测试剂配套的阴性质控品、阳性质控品，以及北京康彻思坦生物技术有限公司生产的高值、低值定值质控品进行室内质控检测。该研究使用的分析仪器和试剂、质控品等经过性能验证后采用到实验中，并符合该次研究的需要，所有试剂和质控品均在有效期内使用，仪器都经过校准并在正常状态下实验，标本及质控品的检测操作严格执行实验室质量体系文件标准操作规程。

1.2 方法

对该分子生物实验室2019年1月—2021年9月间HBV DNA、HCV RNA 检测项目的质控数据进行回顾性分析。按照该实验室质量控制程序制定Lvey-Jennings（L-J）质控图框架，每次实验的质控品检测结果自动计入实验室信息系统并绘制质控图，按照Westgard 多规则质控程序观察质控结果。 设置质控规则，以12S 为警告规则，13S、22S、R4S 为失控标准。 试剂盒阴性质控品与阳性质控品质控规则参考说明书中规定。如有质控失控情况则及时分析与处理，并详细填写室内质控失控报告。 按照失控原因分类，分别统计该实验室2019年1月—2021年9月的失控结果，数据来源于《检验之星》软件及实验室的日常记录表格。

1.3 统计方法

采用SPSS 21.0 统计学软件对数据进行整理，计数资料采用百分数（%）表示。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 基本数据

该实验室2019年1月—2021年9月HBV DNA、HCV RNA 项目质控品检测共1 336 次，失控14 次，总失控率为1.05%（14/1 336）。其中人为因素导致失控的比例较高，共10 次，占比71.43%；质控品因素导致失控2 次，占比14.29%；设备因素、环境因素导致的失控各1 次，各占比7.14%。 见表1。

表1 2019年1月—2021年9月室内质控失控原因统计

2.2 失控情况处理

按统计学原理，由随机误差引起结果超出±3s 范围的可能性为0.3%，发生的概率较低。 室内质控品的检测结果超出±3s 范围的发生，提示可能存在非随机误差或特殊的情况。这种情况产生的原因通常为：仪器、设备误差，如仪器未按要求进行校准；实验环境误差，如温度、湿度超出范围；过失误差，如测量、记录中产生的过失，手工操作时产生的失误等。 对失控情况处理不及时，势必影响临床诊断和治疗工作，造成不良后果。因此，实验室内质量控制失控情况一旦发生，均对失控信息进行详细记录、立即报告小组、科室及质控负责人;当天的该项目检测报告不可填发；并应尽速查清原因、采取纠正措施并记录,必要时复测部分甚至全部标本，重新质控合格后方可填发报告。

2.3 室内质控失控原因分析

①对具体检测过程进行回顾分析失控后，应对该批检测的全过程进行迅速仔细的回顾，分析有无特殊情况，如电压波动导致仪器运行不稳、试剂瓶标签脱落、试剂放置位置不符合要求、质控品瓶盖松动、复溶过程异常等。 并应检查使用的移液器是否进行定期校准，移液器量程是否正确（如刻度旋钮位置发生移动），移液操作过程中是否有液体反冲进入到移液器内部，校准品或试剂有无变更生产厂家批号、接近失效期或超出厂家建议的反复冻融次数，同批次反应管中液体高度是否相等、管中是否有气泡、沉淀、絮状物等。就上述所提及的失控因素，需要在回顾分析中着重观察。采取选择性复查的方式来分析出现失控原因及其解决方案。为表明上述分析的正确性，需进一步完善失控因素，予以标本一个合理安排，一般应进行复测。 复测时，应包括室内质控品及本批次标本，以便尽量一次找出原因,及时发出患者标本的检测报告

②原因分析人为因素：检测人员操作不当导致的质控品检测结果失控现象共10 次， 占比71.43%（10/14）。其中因为新进人员使用移液器不熟练，检测孔内质控品回吸导致的加样量不足3 次，失控率为21.43%（3/14）；操作人员混匀质控品时进行剧烈摇晃而产生气泡，然后使用移液器吸取质控品导致加样量不足1 次，失控率为7.14%（1/14）；在加样时发现提前准备的质控品量不足1次，失控率为7.14%（1/14）；吸取定量标准品的枪头误伸入提取试剂导致污染1 次， 失控率为7.14%（1/14）；加PCR 反应液试剂的枪头触碰到处理好的核酸物质1 次，失控率为7.14%（1/14）；质控品未充分解冻，仪器吸取到的质控品浓度不均匀3 次，失控率为21.43%（3/14）。 质控品因素：质控品储存条件不当导致，通常质控品分装后储存于-20℃以下，反复冻融次数过多会因温度变化会导致质控品的变质，检测结果失控1 次，占比7.14%（1/14）；质控品更换批号导致的失控1 次，占比7.14%（1/14）。 设备因素：移液器未定期校准导致的加样误差，引起室内质控失控1 次，占比7.14%（1/14）。

3 讨论

医学检验结果的好坏与医疗质量有着密切的联系，室内质量控制的主要工作为监测及评价本室工作质量，及实验报告是否发出实施一种检查手段，其核心内容为检测与控制及提高常规工作的质量与准确度。并且注重其准确度所发生的变化，以此来增加日常工作中批间的日间标本检测均相同，无任何差错[7-8]。 控制标本检测的精准度为室内控制的目的，同时观察其精准度发生变化的因素，确保检测结果的相同性，这便要求检验人员在工作中增加自身的工作能力，统一接受系统化、高端的培训，严格遵守质控规章制度等；在仪器使用方面，需定期检查仪器并且对其进行校准，实验室依照实际情况来制订选择定值质控物和非定值质控物，对此，严格要求质控物与患者标本的检查需在同一条件，同一温度下执行，遵守质控物检查制度予以保存，同时及时在保质期内使用，且对质控结果予以合理有效的分析[9-10]。 就此而言室内质控失控的因素为多种，但是均要经过不断的实验来对质控中每个环节，进行细致的观察，记录，调整等，明确每个仪器与试剂的使用，才可在质控工作中大幅度降低失误率，在短时间内找出失控因素且予以相对应的纠正，确保检测结果的准确性[11-12]。分子生物实验室需要建立一套全面的质量管理体系，以期获得及时、准确的检测结果。 室内质量控制的实施涉及到实验室的每个人、每个工作环节，是保证日常检验质量必不可少的措施。 该实验室数据显示，室内质控失控的原因通常为人为因素、试剂因素、设备因素和环境因素等。 实验室应保证室内质控品的检测结果在控，出现失控时应及时查找原因并纠正失控，及时分析失控原因对实验室内质量改进工作具有重要意义。

该实验室失控原因中人为因素占较大比例，应加强操作人员的专业培训与考核工作。要求操作人员熟练掌握实验操作、质量控制等一系列程序，具备生物安全防护意识及防污染意识，严格按照实验室操作规范进行操作与记录。所有标本处理、核酸提取、核酸扩增设备均应按照实验室相关规则以及操作规程进行操作。

质控品参与核酸提取与扩增过程，是核酸检测质量控制的关键手段之一。质控品一般由含有检测靶标的阳性质控与不含有检测靶标的阴性质控组成[13]，质控品的检测与标本检测同时进行。除试剂盒中含有的阳性对照品与阴性对照品作为批内检测质控品外，实验室应采购或制备室内质控品用以监测批间检测差异。质控品在使用过程中，应注意保存、反复冻融等条件，使用前应充分混匀。另外，试剂质量是影响核酸检测质量的重要因素，而试剂盒质量受原料、生产、包装、运输和贮存等条件影响较大，应严格按照试剂说明书使用和贮存。

实验室设备应按期进行维护、校准和性能验证，做好设备使用及检查记录，保证设备处于良好运行状态。另外，设备应定期进行清洁，防止阳性标准品或阳性标本污染设备导致出现假阳性结果[14]。 操作人员一旦发现质控数据有异常情况，一定要及时进行回顾性分析，初步估计失控原因，然后检查试剂及质控品的批号，逐步进行排除[15-16]。尽量避免人为误差，重视对仪器的日常维护也尤为重要。 并且室内质控是检验质量的重要保证，要从每一次的失控中总结经验，吸取教训，进一步提高检验质量[17-18]。

规范的实验室是保证检测工作顺利进行的前提。实验室应按照试剂配制、核酸提取、扩增等环节严格分区管理，规范场地和设备的布局[19]；制定实验室操作、清洁、消毒操作规范与记录文件；保持良好通风条件，避免出现阳性标本、气溶胶、产物污染等因素导致的核酸检测假阳性。

临床实验室要获得可靠的测定结果，需要建立一个全面的质量管理体系。在全面质量管理体系中，实验室质量控制是一个重要的环节，对各实验室质量控制情况，不断进行质量改进，才能达到理想的质量控制结果[20]。

综上所述，分子生物实验室室内质量控制应体现在核酸检测的每一个具体环节中，保证各个环节的有效运行，才能完善室内质量控制工作，充分发挥核酸检测技术优势的同时保证核酸检测结果的及时性、准确性和有效性。