红棕杜鹃根系真菌群落组成与多样性分析

彭黎明, 蒋显锋

(大理大学农学与生物科学学院, 云南 大理 671003)

【研究意义】杜鹃花属植物广泛分布于中国各省市，具有较高的园艺观赏价值。中国横断山区域是杜鹃花属植物的现代分布中心和起源分化中心，全世界有约900种杜鹃花属植物，其中横断山地区就拥有将近500种。中国虽然是杜鹃花属植物的分布中心，拥有丰富的杜鹃花资源，但是对杜鹃花属植物资源的整理、搜集和利用与西方国家相比仍然处于起步阶段。目前，在中国花卉市场上的杜鹃花产品，大部分仍然是以欧洲或日本培育的品种为主。植物根系真菌能够显著的影响植物的养分利用效率，继而影响植物的生长状态[1-2]。菌根是指土壤中某些真菌与植物根的共生体，许多植物都具有自己特有的共生菌根(如兰科、杜鹃花科、松科等)。如丛枝菌根(Arbuscular mycorrhiza，AM)、外生菌根(Ectomycorrhiza，ECM)、内外生菌根(Ectendomycorrhiza，EEM)、兰科植物菌根(Orchid mycorrhiza，OM)、欧石南类菌根或杜鹃花类菌根(Ericoid mycorrhiza，ERM)、浆果鹃类菌根(Arbutoid mycorrhiza，ARM)和水晶兰类菌根(Monotropoid mycorrhiza，MM)[3]。【前人研究进展】植物根系真菌在许多杜鹃花属植物中都曾有过报道[4]。唐燕等[5]从轿子雪山腋花杜鹃中分离出菌根真菌Cryptosporiopsisericae,Drescehlera,Periconia等。Gorzelak等[6]在加拿大落基山脉的越橘属(Vaccinium)植物菌根中检测出Phialocephalafortinii，Oidiodendronmaius，Neonectriaradicicola等内生真菌。熊丹等[7]从黔中马尾松林下的杜鹃花(Rhododendronsimsii)中通过高通量测序检测出子囊菌门、接合菌门和担子菌门等6门19纲103科154属的根系真菌。根系真菌能提高杜鹃花科植物对于养分的利用效率，提高植物对于环境的适应能力[8-9]。最近的研究表明杜鹃花类菌根真菌能增强杜鹃花科植物的耐盐性[10]，并能使其适应长时间的重度干旱胁迫环境[11]。【本研究切入点】红棕杜鹃(Rhododendronrubiginosum)是杜鹃花属杜鹃组亮鳞杜鹃亚组的多年生常绿灌木，产于四川西南部、云南西北部至东北部、西藏东南，常成群落中的优势种。根系真菌会显著影响杜鹃花灌丛的生存状态，同时也是杜鹃花属植物成功引种繁育的重要影响因素[12-13]。然而，红棕杜鹃的根系真菌的多样性与群落组成尚缺少研究。【拟解决的关键问题】本研究将基于大理马耳山的红棕杜鹃群落,并利用高通量测序技术，对红棕杜鹃根系真菌多样性开展研究，为该物种的成功引种驯化提供理论和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 样品采集

马耳山位于云南大理鹤庆县与洱源县交界(26°36′2633″N，100°10′1775″E)，海拔最高处3550 m。2019年8月采集马耳山红棕杜鹃群落30 m × 30 m样方内10株成年植株的须根，采集到的样品带回实验室，用流水冲洗干净去除表面泥沙，用乙醇和次氯酸钠进行消毒后，将样品用无菌水振荡洗涤多次，清洗后的根系样品置于无菌EP管中，每个样品约2 g，并置于-80℃保存。

1.2 样品建库测序

样品送北京擎科生物科技公司做进一步建库测序。具体流程如下：提取样品总DNA后，根据保守区设计得到引物，在引物末端加上测序接头，进行PCR扩增并对其产物进行纯化、定量和均一化形成测序文库，建好的文库先进行文库质检，质检合格的文库用Illumina HiSeq 2500进行测序。高通量测序(Illumina HiSeq测序平台)得到原始图像数据文件，经碱基识别(Base Calling)分析转化为原始测序序列，结果以FASTQ文件格式存储，其中包含测序序列(Reads)的序列信息以及其对应的测序质量信息。

1.3 数据分析

1.3.1 OTU划分与真菌种类鉴定 使用Usearch软件对Tags在97%的相似度水平下进行聚类、获得操作分类单元(Operational taxonomic unit，OTU)，并基于UNITE(真菌)分类学数据库对OTU进行分类学注释。将OTU的代表序列与微生物参考数据库进行比对可得到每个OTU对应的物种分类信息，进而在各分类水平统计各样品群落组成。

1.3.2 样品内真菌多样性分析 采用Alpha多样性对样品真菌多样性进行描述。使用软件Mothur(version v.1.30)，对样品Alpha多样性指数进行评估。

1.3.3 真菌生态功能分析 按照营养方式将真菌分为三大类：病理营养型(Pathotroph)，共生营养型(Symbiotroph)，腐生营养型(Saprotroph)。将三大类进一步又分为12类，成为Guilds。软件FUNGuild(Fungi Functional Guild)是可用于解析真菌OTU的工具，基于该软件对样品进行生态功能分析。

1.3.4 真菌关联网络分析 进行斯皮尔曼(Spearman)秩相关分析并筛选相关性大于0.1且P值小于0.05的数据构建相关性网络，并基于Python绘制根系真菌相关性网络图。

2 结果与分析

2.1 红棕杜鹃根系真菌的种类科属分布

通过对10个红棕杜鹃植株根系样品的高通量测序，获得了有效序列共587 644条，聚合后得到132个OTU，分属于3门、11纲、22目、37科、42属。通过物种分析，主要属于子囊菌门(73.71%)、担子菌门(17.81%)和球囊菌门(0.119%)。主要的纲有锤舌菌纲(60.52%)、伞菌纲(17.77%)、座囊菌纲(5.87%)、子囊菌纲(3.63%)、伞囊菌纲(1.52%)。主要的目有柔膜菌目(58.02%)、伞菌目(13.94%)、煤炱目(5.79%)、肉座菌目(3.44%)、糙孢孔目(1.96%)和刺盾炱目(1.49%)；主要的科有水盘菌科(27.95%)、晶杯菌科(16.18%)、口蘑科(9.96%)、粘毛囊菌科(6.56%)、丛赤壳科(3.27%)、暗色孢科(2.58%)和球盖菇科(2.50%)；占比较高的属有瓶头霉属(27.95%)、小杯伞属(9.96%)、树粉孢属(6.56%)、土赤壳属(3.27%)、粒毛盘菌属(2.59%)、无柄盘属(2.58%)和盔孢伞属(2.50%)。

2.2 红棕杜鹃根系真菌多样性分析

Chao1和ACE指数用于衡量物种丰度即物种数量的多少。Shannon和Simpson指数用于衡量物种多样性。相同物种丰度的情况下，Shannon指数值越大，Simpson指数值越小，说明样品的物种多样性越高。样方内10各植株的Alpha多样性指数值统计如表1所示，植株2号、植株7号的香浓多样性指数(Shannon diversity index)在样品中最高，表明2个样品具有相对较高的物种多样性。各植株样品的OTU数目在24～62，植株间共享OTU数目仅为2个，7号植株具有最多的特有OTU(13个)，3号、5号、9号、10号植株没有特有OTU。

表1 马耳山红棕杜鹃根系共生真菌群落Alpha多样性指数

2.3 红棕杜鹃根系真菌的生态功能多样性

根据FUNGuild分析可知，红棕杜鹃根系真菌包括植物内生菌，排泄物腐生菌，木质腐生菌，兰科根菌真菌等多种生态类型。在检测到的结果中，粪壳菌纲和伞菌纲是主要的腐生型真菌，锤舌菌纲是主要的共生型真菌。本研究中的OTU1，OTU35，OTU73均属于典型的植物内生菌，OTU25和OTU69属于兰科菌根真菌。红棕杜鹃根系真菌样品中，杜鹃花类菌根真菌(ERM)在真菌群落的组成中占较少一部分，多数为各种类型的腐生菌和多种营养型的真菌(表2)。

表2 马耳山红棕杜鹃根系真菌生态功能分析

2.4 红棕杜鹃根系真菌网络关系

图1显示，每个属在平均丰度上都具有一个或多个与其存在关联的属。大多数属之间呈正相关(如Dasyscyphella，Cordyceps和Entoloma)，只有少数几个属间呈负相关(Meliniomyces与Serendipita，Pezicula与Cephalotheca，Chactospacria与Phialocephala，Phialocephala与Solicoccozyma，Chactospacria与Cystofilobasidium)。该关联网络具有39个节点，89个连接，具有较高的模块度(0.531)和嵌套性(0.395)。

圆圈代表物种，圆圈大小代表物种平均丰度大小；线条代表两物种间相关，线的粗细代表相关性的强弱。橙色代表正相关，绿色代表负相关

3 讨 论

3.1 群落组成多样性

根部真菌会显著影响共生植物的养分利用效率，进而决定了植物适应外部环境的能力，并可能影响植物的多样性、群落结构与生态系统稳定性[14]。本研究通过对10个红棕杜鹃个体的高通量测序，获得了滇西北优势杜鹃物种的根系真菌序列共587 644条，聚合后得到132个OTU，分属于3门、11纲、22目、37科、42属。与相同区域的其他杜鹃花属植物相比，大理马耳山红棕杜鹃根系的真菌群落表现出较为丰富的多样性，但相比起亚热带地区杜鹃群落的根系真菌多样性明显较低。

典型的杜鹃花类菌根真菌(ERM)有瓶头霉属(27.95%)和树粉孢属(6.38%)。此外,柔膜菌目的Rhizodermea属和无柄盘属都曾被国内外学者从杜鹃花科植物菌根上分离出来，且被证实为杜鹃花类根菌。有研究表明Rhizodermea属的成员能够与针叶树和杜鹃花科植物形成菌根[15-16]，并有助于形成用于植物根系之间的养分交换的菌丝网络[17-18]。国内外关于杜鹃花菌根真菌的研究中，徐胜男等[19]在贵州百里的马缨杜鹃根菌中，黄彩微等[20]在凉山州龙肘山锈红杜鹃与薄叶马银花根部中，以及在阿根廷巴塔哥尼亚的白珠树属(Gaultheria)的植物菌根中[21]均检测到树粉孢属的真菌，可见树粉孢属是一种广泛存在于世界各地杜鹃花科植物中的ERM真菌。刘振华等[22]在大理的灰背杜鹃根菌中分离出了Phialocephalafortinii，此外还分离出了Cryptosporiopsisericae。Cryptosporiopsis类真菌也是一种常见的ERM类型真菌，多次被国内研究者从各种杜鹃花科植物根菌中分离出来。如刘亚等[23]在浙江大盘山映山红菌根中，唐燕等[5]在云南轿子山腋花杜鹃(Rhododendronracemosum)菌根中，刘仁阳等[24]从贵州梵净山雷山杜鹃菌根中均分离出此类真菌。而此次在大理马耳山红棕杜鹃根部真菌中并未发现Cryptosporiopsis类真菌，推测可能是由于该类真菌具有一定的寄主专一性。

3.2 生态功能多样性

不同生态类型的真菌采取不同的生存策略且具备不同的营养型，对宿主和环境都会产生不同的影响[3]。本研究中的OTU1，OTU35，OTU73均属于典型的植物内生菌，该类真菌广泛地寄生于各种水生及陆生植物。感染内生菌的植株往往比未感染内生菌的植株更具生存竞争力，并表现出生长快速，抗病害，抗动物危害等生存优势[25]。最近的研究表明，根部内生真菌还会影响植物对金属胁迫的耐受性，改善植物的生长和生理[26]。OTU25和OTU69属于兰科菌根真菌，该类真菌除了广泛地寄生兰科植物外，也会选择杜鹃花科植物作为宿主。兰科菌根真菌有着促进兰科植物种子萌发，苗的形态建成，增强植物生态竞争力和抗逆性，帮助植物克服不良生境等生态功能[27-28]。另一种常见的真菌生态类型为腐生营养型(Saprotroph)，腐生营养型又可细分为排泄物腐生菌(OTU74)，叶腐生菌(OTU66)，土壤腐生菌(OTU85)，木质腐生菌(OTU154)等。还有大量未定义腐生菌(Undefined Saprotroph)，主要属于子囊菌门和担子菌门。研究发现红棕杜鹃大量内生真菌表现为多种营养型的组合而并非某种单一的生态类型。如OTU142的Phoma表现为植物内生菌—排泄物腐生菌—地衣寄生菌—凋落物腐生菌—植物病原菌—土壤腐生菌—木质腐生菌多种生态类型。其原因可能是由于真菌为适应复杂多变的生存条件而选择了与之对应的生存策略。在马耳山红棕杜鹃的根部也检测出了例如伞菌目的外生菌根真菌(ECM)。此外，动物病原菌也在多个OTU中被检测出来，它们与各种腐生菌和寄生菌组成了多功能的营养型。

总的来看，杜鹃花类菌根真菌(ERM)在真菌群落的组成中只占很少一部分，而大多数为各种类型的腐生菌和拥有多种营养型的真菌。尽管多种不同生态类型的真菌可以共存于同一植物根系中，但也有研究表明，ECM、ERM、病原菌或其他生态类型的不同真菌物种在植物根系中可能存在竞争[29]。这也为文中的少数几个属在平均丰度上呈负相关提供了可能的解释。植物根系的内生真菌与其宿主间形成了一种动态平衡的关系，真菌群落在植物生长不同阶段也表现出不同的功能[30]。此外，丰富的真菌生态功能多样性也对生态系统的稳定起到积极的作用[31]，并提高地上植物的生产力[32]。

4 结 论

本研究共检测出红棕杜鹃根系真菌群落包括杜鹃花类菌根真菌、兰科植物菌根真菌、腐生真菌、病原真菌、寄生真菌等多种生态类型的真菌，表明该杜鹃属植物具有较丰富的根系真菌生态类型。由于较高的真菌丰富度同时也意味着在该杜鹃引种栽培的过程中必须要考虑根系真菌的影响。由于采样海拔较高，因此红棕杜鹃根系真菌多样性明显低于低海拔地区。本试验为红棕杜鹃物种保育、生态环境的稳定和引种栽培提供了一定的科学借鉴价值。