短期内有机肥增施对高原土壤养分和细菌群落的影响

田夏琼，关统伟，王淑英，汪兰云，张迎春, 李 峻

(1.西华大学食品与生物工程学院，成都 610039；2.西宁市农业技术推广服务中心，西宁 810016；3.青海鲁源农业开发有限公司，西宁 810000)

【研究意义】20世纪以来，为提高农作物产量，化肥被长期使用，这种依赖已经导致日益严重的农业问题[1]，如土壤中微量元素含量下降、土壤结构被破坏等[2]。由于高原土壤水土流失，养分贫瘠等问题较严重，农业生产力持续下降[3]，迫切需要有效的施肥制度来改善突然质量。【前人研究进展】化肥与有机肥配施已被认为是修复被破坏土壤以及维持土壤可持续利用的有效施肥措施[4]。有机肥处理能提高土壤中有机物质的含量[5]，保证农作物生长养分的持久供给。此外，在化肥的基础上施加有机肥能增强农作物抗病虫和抵抗不良环境的能力，同时，对分解土壤中难溶的磷、钾化合物，促进营养元素的吸收和有机碳的稳定也都有重要作用[6]。土壤细菌作为连接土壤和植物的纽带，是维持土壤肥力可持续性以及评价土壤质量的潜在指标[7-8]，且对土壤生态系统有很好的调节作用[9]。细菌丰富度和多样性是土壤细菌群落的关键指标，很容易受到施肥制度的影响[10]，已有学者阐述了土壤细菌群落结构与施肥方式的关联。施用有机肥能提高土壤细菌多样性，化肥则使细菌多样性显著降低[11]。相比化肥，有机肥可以迅速提高土壤细菌数量和种类，从而改善土壤的生态环境[12]。在农田中适当添加有机肥可促进细菌的活动和作物生长，对植物根际细菌的扩散和活性也有积极影响[13]。此外，土壤环境因子也是引起土壤微生物结构改变的重要指标[14]。据报道，土壤含水量、有机质及全氮是影响土壤细菌群落结构的重要因子[15]。因此系统的探究增施不同处理对土壤养分及细菌群落的影响以及两者之间的关系对制定最佳施肥方式，提高土壤质量具有重要意义。【本研究切入点】当前，有机肥对土壤养分及微生物群落结构的影响多为常年田间试验[16]，针对短期大量增施有机肥对高原农业土壤的微生物群落和土壤养分的影响尚少见报道。【拟解决的关键问题】本文以青海西宁的农业土壤为研究对象，探究短期大量增施有机肥对高原土壤理化性质和土壤细菌群落结构的影响，旨在明确在短期有机肥作用下是否可以快速提高土壤养分并且优化细菌群落结构，为农业生态环境可持续发展提供支持。

1 材料与方法

1.1 试验区概况

试验区位于青海省西宁市多巴镇(36°38′43′′N, 101°35′36′′E)，地处湟水河中游，是黄土高原与青藏高原过渡地带，属青藏高原山川地带。试验地点海拔2201～2822 m，年平均气温4.6 ℃，昼夜温差大，年最厚冻土层1.5 m，年平均降水量570 mm，全年无霜期140～150 d。试验前土壤pH 8.72，有机质11.3 g/kg，全氮0.82 g/kg，速效磷85.60 mg/kg，速效钾142.72 mg/kg。

1.2 试验设计

试验区土壤有3种施肥处理：①对照(XN001)：施加100%常规复合化肥1000 kg/hm2(氮)；②处理1(XN002)：50%常规复合化肥+有机肥；③处理2(XN003)：25%常规复合化肥+有机肥。有机肥和化肥均以底肥的形式一次性施入。每种处理的施肥量由表1所示。试验处理土壤面积为90 m2；每个处理设置3个重复；农作物为西葫芦。2018年开始，连续施肥2年后采集土样进行土壤化学性质检测及高通量测序。本试验施用的有机肥和复合化肥均由成都华宏生物科技有限公司提供。

表1 不同施肥处理的养分投入量

1.3 样品采集

采样时间为2020年8月，使用五点法进行采样，收集3个重复样本的采样点土壤(1～30 cm)土层，每个处理共计15个土样；去除根系、杂草等杂质，再将其充分混合后。将每个土壤样本平均分成两份，一份置于-80 ℃冰箱保存，用于DNA 的提取；另一份自然风干过筛后用于理化指标的测定。

1.4 土壤理化参数测定

土壤pH测定采用酸度计法(土水比1.0∶2.5)；土壤全氮的测定采用半微量凯氏定氮法；土壤铵态氮、硝态氮的测定采用0.01 mol/L CaCl2浸提—流动分析仪测定；土壤有效磷的测定采用0.5 mol/L NaHCO3浸提—钼锑抗比色法；有效钾的测定采用1 mol/L NH4Ac浸提—原子吸收火焰光度法；有机质测定采用浓硫酸—重铬酸钾消煮—硫酸亚铁滴定法[17]。所有理化性质的测定重复3次，结果用平均标准偏差表示。

1.5 土壤DNA提取和PCR扩增

采用E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit试剂盒提取土壤DNA，具体操作按说明书使用。所提取的总DNA于-20 ℃保藏备用。

PCR所用的引物为测序平台的V3～V4通用引物341F(5′-CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTG-3′)和805R(5′-GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGA ATTCCA-3′)，第一轮扩增体系如下：2×Taqmaster Mix 15 μL，Bar-PCR primer F(10 μmol/L)1 μL，Primer R(10 μmol/L)1 μL，Genomic DNA 10～20 ng，H2O add to 30 μL。第一轮反应条件为：94 ℃预变性3 min；5个循环(94 ℃ 30 min，45 ℃20 s，65 ℃30 s)；25个循环(94 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s)；72 ℃延伸5 min。第二轮扩增体系为：2×Taqmaster Mix 15 μL，Primer F(10 μmol/L)1 μL，Primer R(10 μmol/L)1 μL，PCR products(上一轮)20 ng，H2O add to 30 μL。第一轮反应条件：95 ℃预变性3 min；5个循环(94 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s)；72 ℃延伸5 min。

1.6 高通量测序及数据处理

PCR产物经过纯化由生工生物工程(上海)股份有限公司完成测序。所有序列都保存在NCBI的SRA(Sequence Reads Archive)数据库中，获得登录号为SRR10559325、SRR10559324和SRR10559323。对各样本数据的质量进行质控过滤；使用Usearch 5.2.236去除预处理后序列中非扩增区域序列，而后对序列进行测序错误校正，并调用Uchime 4.2.40进行鉴定嵌合体，得到最终有效数据；Microsoft Excel 2019对数据进行整理；用Mothur 1.30.1分析细菌群落的丰富度和多样性；SPSS 21.0进行Pearson相关性分析；PICRUST软件用于KEGG功能预测分析。

2 结果与分析

2.1 增施有机肥对土壤化学性质的影响

不同施肥处理对土壤的化学性质产生了影响(表2)。土壤pH由8.41降至7.62，在3种处理下差异显著。在XN003处理下，土壤中有机质、全氮、有效磷、有效钾含量显著高于XN001，分别提高了117.21%、51.72%、27.45%、20.92%。有效铜、有效铁含量也随着有机肥的施用而增加。

表2 不同施肥处理对土壤化学性质的影响

2.2 增施有机肥对土壤细菌丰度和多样性的影响

Chao1指数和ACE指数可用来反映微生物群落物种丰富度，数值越大，表明群落丰富度越高。由表3得出，XN002处理下的Chao1指数和ACE指数比XN001分别高出0.44%、0.04%。XN003表现出的丰富度指数最高，Chao1指数和ACE指数分别为19363.59、30121.25，比XN001高出6.69%和4.45%。Shannon指数和Simpson指数用来估算样本中的微生物的多样性，前者数值越大，后者数值越小说明群落多样性越高。发现在XN002处理下，Shannon 指数降低，Simpson 指数升高，土壤细菌多样性相比对照有所下降。XN003处理下的土壤细菌多样性有一定提高，但差别不大，提高了0.1个单位。

表3 不同样本土壤细菌Alpha指数差异

2.3 增施有机肥对土壤细菌群落结构的影响

3个样本共归类到30个门(图1)，XN001、XN002、XN003处理下分别归类到26、27、28个门。占比较高(相对丰度>5%)的5个菌门，包括变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线菌门(Actinobacteria)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)，平均相对丰度分别为42.36%、11.66%、10.62%、10.39%、5.20%。其中，变形菌门在XN002和XN003处理下的相对丰度相比XN001分别高出20.7%和13.97%。酸杆菌门在XN001处理下的丰度为11.90%，在XN003处理下为14.89%，比XN001处理提高了3.99%。放线菌门在XN001处理的相对丰度为16.49%，XN002处理为9.01%，XN003处理为5.66%，分别降低了7.48%和10.83%。门水平上相对丰度在1%以上的细菌的有浮霉菌门(Planctomycetes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、厚壁菌门(Firmicutes)、绿弯菌门(Chloroflexi)，分别占比3.17%、2.51%、1.59%、1.22%。施加有机肥降低了放线菌门的丰度，提高了变形菌门、酸杆菌门的丰度。

图1 细菌在门水平上的相对丰度

3个样本共归类到501个属(图2)，XN001处理下归类到357个属，XN002处理下有402个属，XN003处理下有362个属。占比例较高(相对丰度>5%)的2个菌属是鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)和芽单胞菌属(Gemmatimonas)，分别平均占到所有菌属的6.20%和5.20%。鞘氨醇单胞菌属在XN001处理下的相对丰度为4.78%，在XN002和XN003处理下的相对丰度分别为6.32%和7.51%，提高了1.54%和2.73%。芽单胞菌属的相对丰度在XN001处理下为6.95%，XN002和XN003处理分别比XN001处理减少了4.19%和1.05%。在属水平上相对丰度大于1%的有溶杆菌属(Lysobacter)、藤黄色单胞菌属(Luteimonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)、GP6、Ohtaekwangia、GP4、GP16、GP7。鞘氨醇单胞菌属在3种处理中都是相对丰度较高的属，有机肥施用量越大，鞘氨醇单胞菌属和假单胞菌属的相对丰度越高。除此之外，其他类群的相对丰度也发生变化，施用有机肥均降低了芽单胞菌属的相对丰度，增加了假单胞菌属、溶杆菌属、鞘氨醇单胞菌属的相对丰度。

图2 细菌在属水平上的相对丰度

2.4 土壤细菌多样性与环境因子的相关性

由Pearson相关性分析(表4)发现，土壤细菌群落的丰富度和多样性与有机质、全氮、有效磷、有效钾、有效铜、有效铁呈正相关，相关系数在0.074～0.953。细菌丰富度与有机质的相关性最高，Chao1指数和ACE指数与有机质的相关系数分别为0.953、0.936，与其他环境因子的相关性也较强。土壤细菌的丰富度和多样性与pH呈负相关，相关系数在0.149～0.877。其中多样性指数(香农指数)与有机质、pH、全氮、有效磷和有效铜的相关性较强。

表4 土壤细菌群落α-多样性指数与土壤化学性质之间的Pearson相关性

2.5 KEGG功能预测

2.5.1 XN001和XN002处理土样 KEGG 代谢途径差异分析 本研究通过对检测到的329个3级KEGG直系同源物的整理，比较了不同施肥方式下KEGG代谢途径的主要功能基因(图3)，发现增施有机肥处理与对照组处理下的土壤细菌代谢功能差异显著。在XN002处理下,谷胱甘肽代谢、孔隙离子通道、乙醛酸和二羧酸代谢、光合作用蛋白等功能基因的丰度明显高于对照组。叶绿素等功能基因丰度在小范围有所下降。以上结果表明增施有机肥处理影响了土壤的代谢途径，一部分有益功能基因的表达增强，代谢途径得到进一步推动。

图3 增施有机肥(XN001→XN002)处理下KEGG代谢途径差异

2.5.2 XN002和XN003处理土样 KEGG 代谢途径差异分析 以XN003施肥方案处理的土壤细菌KEGG代谢途径变化显著(图4)。分析发现，XN003与XN002相比，复制、重组和修复功能得到较强的提升。此外，嘌呤嘧啶代谢、糖基转移酶等功能基因也有一定程度的上调。而一些疾病合成以及丙酮酸代谢等功能基因的丰度小幅度降低。值得关注的是，在进一步大量增施有机肥的情况下，乙醛酸和二羧酸代谢基因有一定范围内的下调。

图4 增施有机肥(XN002→XN003)处理下KEGG代谢途径差异

3 讨 论

3.1 大量增施有机肥对土壤养分的影响

土壤有机质能反应土壤肥力高低，在农作物生长中发挥重要作用[18]。Wang等[19]通过20年长期田间试验发现在有机肥处理下，有机质含量从8 g/kg增加到约16 g/kg，提高了100%。本研究结果显示在2年有机肥处理下，有机质含量水平提高了117.21%，一定程度上验证了通过短期增施有机肥提高土壤肥力的可行性。土壤pH受施肥制度的影响[20]，在pH大于8.11的碱性土壤中，长期施用有机肥使其pH降至7.82[21]，而在弱酸性土壤条件下，施加有机肥则使土壤pH从6.73恢复至7.07[22]。本实验显示增施有机肥使得强碱性土壤(pH=8.41)恢复至接近中性(pH=7.62)，这可能归因于施肥刺激硝化反应和H+的释放[23]，另一方面可能是由于有机肥中有机酸积累所致[24]。综合以上分析，有机肥可能具有调节土壤酸碱性的潜力，其中的调节机制在未来值得进一步研究。此外，土壤的有效钾、有效磷、全氮含量在增施有机肥处理下均明显提升，与前人给出的研究结果一致[25-26]。通常，氮、磷、钾等是控制生物圈中有机物循环的主要营养元素[27]，其中磷还被认为是土壤代谢途径的关键元素[28]，本研究发现的一部分代谢途径的增强可能在一定程度上得益于以上微量元素含量的增加。而铜和铁能促进农作物的光合作用和提高农作物抗病、抗寒、抗旱和抗热的能力，增施有机肥提高了土壤中有效铜和有效铁含量，且含量值低于对土壤造成重金属污染的临界值(12.23 mg/kg)[29]，这对高原农作物的生长有积极作用。

3.2 细菌群落结构受施肥制度的影响

本研究通过对3种施肥方式下土壤细菌群落的研究发现，在短期条件下，有机肥的增施的确影响了土壤的细菌群落。ACE指数和Chao1指数的变化都反映了土壤细菌丰富度在短期内与有机肥施加量成正比关系，这一结论符合众多研究有机肥对细菌群落结构影响的结果[30]。然而在多样性方面，有机肥似乎发挥了反作用。在XN002处理下，细菌多样性明显降低，XN003处理下细菌多样性与对照基本保持一致，这与Tian等[31]的研究结果类似。细菌多样性降低的情况可能与有机肥施用量有关，大量的有机肥本身带入的细菌刺激了土壤细菌群落的稳定性，导致某些对外源细菌类群有抵抗作用的微生物大量繁殖，从而促使了细菌多样性的下降，这也解释了2级水平上外源生物降解和代谢等功能基因的上调。尽管短期有机肥施加对细菌多样性的影响并不显著，但几种有益菌丰度的增加还是为土壤质量带来了积极影响。酸杆菌门和变形杆菌门在有机肥处理下的丰度高于化肥处理，这将为有机碳、氮、磷和硫化合物的转化提供动力[32]。另外，酸杆菌门对铜和镍等重金属有很强的耐受性[33]，对被重金属污染的土壤可能起到一定的修复作用。优势的变形菌门则可提高土壤细菌对测试样本高原不良环境的变化适应能力[34]。鞘氨醇单胞菌属以代谢复杂的有机污染物而闻名[35]，这对减少土壤污染，推进污染物降解和提高土壤质量做出了贡献。假单胞菌属具有的防病害功能[36]，也在一定程度上起到对农作物健康生长的保护作用。

3.3 细菌群落与土壤环境因子的关系

本研究发现土壤pH、有机质、全氮、速效磷、速效钾、有效铜、有效铁含量影响了细菌群落结构，其中有机质是驱动细菌群落结构变化的最重要因素。有机质能被分解为土壤细菌生长所需的营养物质，在养分循环中发生作用[37]，因此，土壤细菌的丰富度和多样性与有机质呈强烈的正相关。众多研究表明pH也是影响土壤细菌群落结构的又一重要因素[38-39]。本研究中，土壤细菌丰富度与pH呈强烈负相关，pH下降促进了土壤细菌丰度的提高。这可能是由于土壤中原本存在一部分对pH有强烈依赖的细菌，这或许可以很好的解释放线菌门丰度的降低，因为放线菌被报道通常存在于极端土壤条件下，对pH要求极高[40]。此外，土壤细菌群落结构与全氮、有效磷、有效钾、有效铜和有效铁含量均呈正相关，这与前人研究结果不谋而合[41]。因此，可以推测通过农田土壤施用有机肥能够改变土壤的环境因子，进而影响土壤细菌的群落结构，反之，细菌也为分解养分做出贡献[42]，这种良性循环营造了可持续土壤生态环境。

3.4 增施有机肥对细菌功能的影响

KEGG代谢途径分析结果表明，短期增施有机肥可增强土壤细菌的代谢以及传输等功能。这与长期有机肥处理下的土壤代谢途径结果相似[43]，表明有机肥对土壤代谢途径的有利影响并不受到时间的限制。铜绿假单胞菌和嗜冷假单胞菌已被报道可促进γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的分泌，从而合成谷胱甘肽[44-45]。本研究有机肥的增施使得丰度提高的假单胞菌作为介导，促进了谷胱甘肽的代谢，其在抵抗外源物质对农作物毒害方面发挥着重要作用[46]。此外，孔隙离子通道功能基因的加强使得农作物能够更好的吸收或外排矿物质营养素，以维持营养平衡并调节生理功能。糖类物质对光合作用的反馈尤其重要，有机肥增施刺激糖类物质释放可能是光合作用蛋白基因对有机肥敏感的原因[47-48]。乙醛酸和二羧酸代谢连接着嘌呤代谢、甘氨酸和苏氨酸等代谢，在平衡植物及微生物代谢发挥关键作用[49]，XN003处理降低了乙醛酸和二羧酸代谢基因丰度，对土壤的养分循环和生态稳定有不利影响。

4 结 论

有机肥替代部分化肥后，土壤养分含量和细菌多样性得到了提高。土壤细菌丰富度以及功能基因丰度在持续大量有机肥(XN003)刺激下表现出削弱的趋势。因此，在本研究条件下，以50%的化肥配施30 000 kg/hm2的有机肥足够让高原土壤的养分含量提高，并改善土壤的细菌群落结构。本研究结果反映出了短期大量增施有机肥在施肥方案上的潜力，然而未来还需在本研究的基础上对有机肥与化肥的精准配施比做更深入的研究，为农业可持续发展提供科学支持。