银铂复合纳米材料的制备及其抗菌性能

刘雲凤，李慧慧

华中农业大学 理学院，湖北 武汉430070

0 引 言

耐药菌相关疾病蔓延迅速，如不采取措施加以遏制，预计2050 年后每年死于耐药菌感染的人数将达到1 000 万[1]。同时，菌株的耐药性也会导致使用抗生素的常规治疗疗效越来越差。所以，开发新型高抗菌活性和低耐药性的抗菌药物具有重要意义[2]。

纳米材料具有独特的催化和氧化能力，是抗菌应用平台的理想候选材料[3～5]。大量科学研究发现，银纳米粒子对一些常见的细菌具有高效的杀灭作用，例如大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌等[6]。细胞中的生物大分子因含有硫、氧、氮原子而具有丰富的给电子基团，能与银离子发生相互作用而导致其失去活性，进而导致细胞破损、死亡[7]。为了更加充分地发挥银的抗菌活性，一系列新颖的银纳米复合材料被制备并用 于 抗 菌 研 究[8，9]。2010 年，Chen 等[10]用 金 红 石 型TiO2作为载体制备了纳米银与TiO2的复合材料Ag@TiO2，发现当Ag@TiO2用量为10 μg/mL 时可完全抑制大肠杆菌的生长，明显优于单独的TiO2和Ag 纳米颗粒。在抗菌材料中，金属铂的抗菌活性也引起了极大关注。2017 年，Cai 等[11]采用脱合金工艺，以氯铂酸和硝酸银为前驱体、甲醛为还原剂、多环芳烃为表面活性剂，制备了一系列PtxAg100-x(0＜x＜100)纳米粒子，其中脱合金后的D-Pt50Ag50用量为20 μg/mL 时可抑制约半数大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长。

本文以TiO2/C 微球负载铂纳米线的复合物Pt/TiO2/C（PTC）为载体，表面负载纳米银，制备银和铂的复合纳米材料Ag-Pt/TiO2/C（APTC），再通过3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB）的氧化测试研究该复合材料的氧化物模拟酶活性和过氧化物模拟酶活性，并考察了复合材料的抗菌性能、对大肠杆菌的最低抑菌浓度以及抗菌机理。

1 实验部分

1.1 主要试剂与仪器

试剂：PTC 为实验室自制；大肠杆菌（Escherichia coliK12）由实验室培养；Luria-Bertani（LB）液体培养基配方为1%氯化钠（m/V），1%胰蛋白胨（m/V），0.5% 酵母提取物（m/V），1.5% 琼脂粉（m/V）；所有试剂均为分析纯或更高纯度，使用前无需进一步纯化，均购自上海国药集团；所有溶液均为超纯水配制。

仪器：UV-1800 型紫外-可见分光光度计（UVVis，Shimadzu 公司），Multiskan GO 型全波酶标仪（Thermo Scientific 公司），OTF-1200X-S 型管式炉和KSC-1100X 型马弗炉（合肥科晶材料技术有限公司）；采用D8 Advance 型X 射线衍射仪（XRD，Bruker 公司）分析样品中银和铂的晶体结构；采用SU8010 型扫描电子显微镜（SEM，Hitachi 公司）表征样品的形貌；采用JEOL-2100F 型透射电子显微镜（TEM，JEOL 公司）上的能量色散谱仪（EDS）研究样品中各元素的分布；利用Agilent7900 型电感耦合等离子体-质谱（ICP-MS，Agilent 公司）检测样品中Ag 的负载量。

1.2 材料制备

1.2.1 银纳米粒子的制备

用抗坏血酸还原AgNO3法合成银纳米粒子。在2.4 mL 水 中 加 入300 μL 5.6 mg/mL AgNO3溶液和300 μL 29 mg/mL 抗坏血酸，超声分散。混合溶液在旋转混匀器上反应1 h，离心，去掉上清液，得到银纳米粒子，在水中超声清洗3 次，再用无水乙醇洗涤1 次，置于真空干燥箱中于50 ℃干燥12 h，得到银纳米粒子。

1.2.2 APTC 复合材料的制备

将3 mg PTC 加入到2.4 mL 超纯水中，超声分散，加入300 μL 5.6 mg/mL AgNO3溶液，混匀，再加入300 μL 29 mg/mL 抗坏血酸。将该混合溶液置于旋转混匀器上反应1 h，离心，去上清，沉淀用超纯水洗涤3 次，无水乙醇洗涤1 次，然后置于真空干燥箱中于50 ℃干燥12 h，得到APTC 复合材料。

1.3 氧化模拟酶和过氧化物模拟酶活性测试

在加或不加H2O2条件下测吸光度，用TMB 氧化法对APTC 的过氧化物模拟酶和氧化模拟酶活性进行研究，并测试了pH 值对氧化模拟酶和过氧化物模拟酶活性的影响。反应均在10 mmol/L 磷酸盐缓冲溶液（PBS）中进行，监测体系在652 nm 处的吸光度变化。具体步骤为：分别取400 μL pH 值为4.0、5.0、6.0、7.0 的PBS 于4 个离心管中，依次加 入40 μL APTC（1 mg/mL）、40 μL TMB 溶 液（10 mmol/L）和20 μL 的H2O2(50 mmol/L)，放置10 min 观察其颜色变化，并测试样品的UV-Vis 吸收光谱。

1.4 抑菌性能测试

1.4.1 APTC 的抑菌效果

细菌悬浮液A：将处于对数生长期的大肠杆菌母液用pH 7.0 的PBS 稀释至1.0×108CFU/mL。细菌悬浮液B：将细菌悬浮液A 分别与不同浓度APTC 等体积混合，并在旋转混匀器上反应4 h，混合后APTC 浓度分别为0.25、0.5、1、2 μg/mL。细菌悬浮液C：将细菌悬浮液B 稀释104倍。细菌悬浮液D：在细菌悬浮液B 中添加H2O2（1 mmol/L），然后稀释104倍。分别将100 μL 细菌悬浮液C 和D 涂布于固体培养基上，于37 ℃培养12 h，考察APTC的抑菌效果。另设置3 个对照组（E. coli、E. coli+APTC、E. coli+1 mmol/L H2O2）同时进行实验。

1.4.2 APTC 对细菌细胞壁的损伤

取1 mL 细菌悬浮液B 于离心管内，以4 000 r/min 离 心10 min，去上 清，沉 淀 用pH 7.4 的PBS 洗涤3 次，向沉淀中加入1 mL 质量分数2.5%的戊二醛PBS 溶液，混匀后于冰箱中4 ℃静置10～12 h，取出，以4 000 r/min 离心10 min，去上清，沉淀先用PBS 洗涤3 次，再按照乙醇体积百分数30%、50%、70%、80%、90%、100%的顺序进行梯度脱水洗涤，离心，每次10 min。将脱水洗涤后的菌体用100%叔丁醇超声重悬两次，每次半小时，于室温下真空干燥，得到粉末样品。用扫描电子显微镜观察样品形貌。对照组为细菌悬浮液A。

1.4.3 APTC 的最低抑菌浓度

取5 个离心管，以LB 培养基作溶剂，依次配制浓度为100、50、25、12.5、6.25 μg/mL 的APTC 溶液。将培养至对数期的细菌离心后，用LB 培养基稀释至浓度为1.0×106CFU/mL，得到细菌悬浮液E。取上述5 个浓度的APTC 溶液分别与细菌悬浮液E 等体积混合，得到5 个混合溶液，其中APTC 浓度依次为50、25、12.5、6.25、3.125 μg/mL。以96孔板作为反应器，每孔中注入100 μL 上述混合溶液，设置3 组平行实验。另设阳性对照（100 μL 含有相同细菌浓度的培养基）和阴性对照（100 μL 培养基）各3 组。将96 孔板于恒温箱中37 ℃放置12 h，用酶标仪测得各实验组于600 nm 处的光密度（OD600nm），考察APTC 的最低抑菌浓度。

2 结果与讨论

2.1 材料表征

从图1(a)(b)APTC 的SEM 图可以看到，复合材料呈球状形貌，直径约600 nm，表面覆盖着纳米尺寸的颗粒。进一步研究了复合材料的元素分布，由图1(c)～(g)可以清晰地看到，复合材料中均匀分布着C、O、Pt、Ag 和Ti 元素，证明复合材料表面成功负载了银纳米粒子。另外，通过ICP-MS 测得APTC 中Ag 实际负载量为14.30%（质量分数）。

利用XRD 对APTC 和PTC 的晶体结构进行了分析，结果如图2 所示。PTC 的XRD 图中在39.5°、46.2°、67.3°处出现3 个峰，分别归属为Pt 的3 个晶面（111）、（200）、（220）。APTC 的XRD 图 中 在38.0°、45.0°、65.0°、75.0°处出现4 个峰，分别对应Ag 的4 个晶格面（111）、（200）、（220）、（311），且Ag和Pt 的衍射峰分开，证明该复合材料中银和铂没有形成合金化结构，各自保持为典型的面心立方结构[12]。

图2 APTC 和PTC 的XRD 图Fig.2 XRD patterns of APTC and PTC

2.2 APTC 的氧化模拟酶和过氧化物模拟酶活性

在加或不加H2O2条件下测吸光度，对APTC 的过氧化物模拟酶和氧化模拟酶活性用TMB 氧化法进行了研究。如果溶液颜色变深，同时观察到在625 nm 处有明显的吸收峰，则说明TMB 被氧化。溶液的吸光度越高，表明材料的氧化能力越强。图3（a）显示，TC+TMB 体系在pH 6.0 或7.0 时几乎没有颜色变化，pH 5.0 时为轻微的蓝色，吸光度为0.20，pH 4.0 时体系显示为较深的蓝色，吸光度达到1.07。这说明PTC 在偏中性环境下的催化剂几乎没有氧化酶活性，而在偏酸性环境下具有明显的氧化模拟酶活性，且酸性越强氧化酶活性越好。图3（b）显示，PTC+TMB+H2O2体系在pH 7.0 时无颜色变化，此时体系没有过氧化物模拟酶活性；在pH 5.0 和6.0 时都有明显的颜色变化，吸光度也随之增大；pH 4.0 时体系蓝色更深，吸光度为2.16，明显高于PTC+TMB 体系的吸光度。这说明PTC在偏酸性条件下具有过氧化物模拟酶活性，可能氧化H2O2产生羟基自由基[13]。综上所述，只有在偏酸性环境下，PTC 的氧化模拟酶活性和过氧化物模拟酶活性才能显现出来。

图3（c）显示，APTC +TMB 反应体系在不同pH 值条件下均没有明显变蓝色，但其吸光度在偏酸性条件下有微弱上升，表明APTC 具有较弱的氧化模拟酶活性，能够产生少量的活性氧。这是由于复合材料中纳米铂产生的活性氧首先氧化了负载在其表面的银纳米粒子，使溶液中的活性氧浓度降低，从而减弱了对TMB 的氧化。图3（d）显示，APTC+TMB+H2O2体 系 在pH 5.0、6.0 和7.0 时均呈现蓝色，且吸光度随着pH 值的增大而增大，变化趋势与图3（b）相反。推测是由于酸性条件下复合材料中纳米铂产生的活性氧首先将其表面的纳米银氧化为银离子，从而削弱了APTC 对H2O2产生羟基自由基的催化作用；随着pH 值的增大，复合材料中纳米铂产生的活性氧变少，纳米银的量相对增加，增强了APTC 对H2O2产生羟基自由基的催化作用，能够产生更多的羟基自由基，从而促进了蓝色氧 化 态TMB 的 生 成[14]。

图3 4 个反应体系不同pH 值的氧化模拟酶和过氧化物模拟酶活性（插图为对应的TMB 显色照片）Fig.3 The oxidative mimics enzyme and peroxidase mimetic activity of four reaction systems at different pH (the inset is the photo of the corresponding TMB color reaction)（a）PTC +TMB；（b）PTC +TMB+H2O2；（c）APTC +TMB；（d）APTC +TMB+H2O2

基于上述结果，APTC 可用于抗菌应用相关的研究。

2.3 APTC 的抗菌性能

在培育细菌的过程中，通过监测细菌悬液的OD600nm值，可以判断细菌生长是否进入对数期。选择处于对数期生长的细菌进入后续研究。

图4（a）显示，当细菌的存活率分别为83.64%、68.87%、53.03%和0 时，相应的复合材料用量分别为0.25、0.5、1、2 μg/mL。随着APTC 用量 的 增加，E.coli菌落数有明显减少的趋势，当APTC 用量为2 μg/mL 时，杀菌率达到100%。进一步探究了H2O2对反应体系的影响。图4（b）显示，在H2O2存在条件下，细菌存活率分别为69.09%、34.84%、8.71%、0 时，APTC 用 量 分 别 为0.062 5、0.125、0.25、0.5 μg/mL。实验数据说明，H2O2使得复合材料的抗菌能力显著增强，当APTC 用量为0.25 μg/mL 时就可以杀灭91.29%的细菌，用量仅为未添加H2O2所需APTC 的12.5%。这与APTC 的氧化模拟酶和过氧化物模拟酶的实验结果一致。在不加H2O2时，APTC 中由于协同作用生成的银离子具有抗菌作用[15]；在加H2O2时，APTC 中的纳米银和纳米铂都对H2O2产生羟基自由基具有催化作用，通过损坏细菌细胞膜的功能[16]达到杀菌的目的。

图4 不同处理后细菌存活率柱状图（a）：①空白对照，②～⑤APTC（0.25，0.5，1，2 μg/mL）；（b）：⑥H2O（21 mmol/L），⑦～⑩APTC（0.062 5, 0.125, 0.25, 0.5 μg/mL）+H2O（21 mmol/L）Fig.4 The corresponding bar graph of bacterial survival rate after different treatments（a）：①Blank，②～⑤APTC（0.25，0.5，1，2 μg/mL）；（b）：⑥H2O（21 mmol/L），⑦～⑩APTC（0.062 5, 0.125, 0.25, 0.5 μg/mL）+H2O（21 mmol/L）

由图5（a）大肠杆菌和APTC 处理过的大肠杆菌的SEM 图像可见，表面比较光滑的是正常的E.coli，而被APTC 处理后，细菌表面变得粗糙，表明细菌的细胞壁受到了损伤。这种损伤可以从两方面解释：一是APTC 复合材料产生的银离子与细胞内含S、O 或N 生物大分子上的给电子基团相互作用致其失活[7]，从而导致细胞破损而死亡；二是银离子通过静电吸附与细菌上带有负电荷的蛋白质结合，从而导致细胞壁的功能受损[17]。

图5 大肠杆菌（a）和APTC 处理过的大肠杆菌（b）的SEM 图Fig.5 SEM images ofE. coli(a)andE. colitreated by APTC (b)

进一步测试了APTC 复合材料的最低抑菌浓度。将一定量的细菌分别与不同用量的APTC 复合材料（3.125、6.25、12.5、25、50 μg/mL）37 ℃培养过夜，设置3 组平行实验。表1 为对应的OD600nm的数据。除去阴性对照的值，APTC 用量为50 μg/mL时OD600nm值最小；随着APTC 用量的减少，OD600nm值逐渐增大；扣除阴性对照背景值之后，APTC 用量 为50 μg/mL 与25 μg/mL 时，OD600nm值 均 小 于0.1，APTC 用量 为25 μg/mL 时溶 液是澄 清的，当APTC 用量降至12.5 μg/mL 时溶液呈现浑浊。因此，APTC 的最低抑菌浓度为25 μg/mL。测试了添加H2O2对复合材料抗菌效果的影响，发现体系中是否添加H2O2抗菌效果相差不多。推测是由于体系在37 ℃下培育，较高的温度使H2O2分解，其作用未得到体现。另外还制备了银纳米颗粒用于抗菌实验，当其浓度为50 μg/mL 时未显示出明显的抗菌效果，说明由于APTC 复合材料中各成分的协同作用，增强了整体的抗菌能力。

表1 不同用量APTC 与细菌孵育过夜后体系的OD600 nmTable 1 OD600 nmof APTC with different concentration and bacteria incubated overnight

3 结 语

本文在TiO2/C 微球负载铂纳米线表面负载银纳米粒子，制备了多元银铂复合纳米材料APTC，并通过XRD、SEM、EDS 等技术进行表征。TMB氧化实验结果表明，相对于PTC，APTC 复合材料在中性条件下有着更好的过氧化物模拟酶活性。抗菌实验结果表明：APTC 复合材料对大肠杆菌具有很好的抗菌能力，用量为2 μg/mL 时，仅通过与大肠杆菌混合放置，杀菌率就达到100%，进一步在体系中加入1 mmol/L H2O2后，则只需要0.25 μg/mL，抑菌率就达到91.29%，此用量仅为未加H2O2时用量的12.5%；APTC 复合材料的最低抑菌浓度为25 μg/mL。综上所述，APTC 复合材料用于抑菌有潜在的应用前景。